Mikrobiologie 2. Semester - ZHAW

• flüssig/fest
• flüssige Nährmedien sind z. T. komplexe Medien (enthalten organische Bestandteile, Zusammensetzung ist meistens nicht genau bekannt),
  • Sie werden für die Anreicherung von Bakterien, die Überprüfung von Reinkulturen oder die Gewinnung grösserer Zellmengen benutzt
• feste Nährmedien werden für die Keimzahlbestimmung oder die Gewinnung, Überprüfung oder Aufbewahrung von Reinkulturen benutzt
  • flüssige Nährmedien werden mit Agarbeigabe oder Gelatine in feste Form gebracht

• feste Nährmedien werden für die Keimzahlbestimmung oder die Gewinnung, Überprüfung oder Aufbewahrung von Reinkulturen benutzt
• flüssige Nährmedien werden mit Agarbeigabe oder Gelatine in feste Form gebracht

• synthetische Medien enthalten aussschliesslich chemisch exakt definierte Bestandteile in bekannter Konzentration (z.B. Zucker, Alkohole, Fettsäuren und Stickstoffquellen)
• Komplexmedien enthalten ein oder mehrere organische Bestandteile, deren chemische Zusammensetzung nicht genau bekannt ist
• Minimalmedien enthalten die unbedingt notwendigen Stoffe, Vollmedien enthalten dagegen noch weitere Verbindungen, die jedoch nicht überlebensnotwendig sind, das Wachstum aber fördern. Ein komplexes Medium ist immer ein Vollmedium

• Es wird zwischen Universalnährmedien, Selektivnährmedien und Differenzialnährmedien unterschieden
• Universalmedien sind Komplexmedien, die für eine Vielzahl von MO geeignet sind
• Selektivnährmedien werden für die weitgehende Isolierung von bestimmten MO oder MO-Gattungen eingesetzt. Es gibt flüssige und feste Selektivnährmedien (für Anreicherung oder Isolierung)
• Differenzialnährmedien reagieren mit Stoffwechselprodukten und verändern dadurch ihre Farbe

Für die Anzucht von Bakterien können viele verschiedene Nährmedien eingesetzt werden:

• Bouillonkultur
• Plattenausstrich
• Gusskultur
• Schüttelkultur
• Agarschrägkultur

Die verschiedenen Bebrühtungsarten haben dabei unterschiedliche Ziele. Die Bebrühtung erfolgt in einem Brutschrank, in welchem Temperatur, Zeit und eventuell Sauerstoffverhältnisse angepasst werden können. Platten werden meistens mit dem Deckel nach unten bebrühtet.

Es gibt verschiedene Aufbewahrungsmethoden für Bakterien. Man unterscheidet dabei zwischen Referenzstämmen (Mo mit ganz bestimmten Eigenschaften wie z.B. Candida albicans), Stammkulturen (Subkultur eines Referenzstammes) und Gebrauchskulturen (Subkulturen von Stammkulturen)

Die Referenzstämme können u.a aus folgenden Stammsammlungen bezogen werden

• ATCC: American Type Culture Collection
• DSM: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
• CBS: Centralbureau voor Schimmelcultures

Dort werden die MO entweder Trockenkonserviert (Gefriertrocknung, auf Silikagel oder Gelatineblättchen) oder Gefrierkonvserviert (Stickstoff oder Glasperlen bei -70 °C). Die MO überleben dabei zwischen 10 und 30 Jahren.

Für kurzfristigere Aufbewahrung eignen sich auch Schrägagarkulturen, Agarstrichkulturen oder die Konservierung unter Paraffinöl.

Beim Revitalisieren werden die konservierten MO (in Röhrchen oder Öse) mit BHI-Bouillon versetzt und in ein Reagenzglas gebracht. Die enthaltenen Nährstoffe reichen ca. 24h aus. Nach diesen 24h sind alle Nährstoffe verbraucht und die MO sterben ab. Deswegen werden sie spätestens während der stationären Phase weiterverarbeitet (am besten während der Log-Phase). 

Mit dem Drei-Ösen-Ausstrich mit einem selektiven Nährmedium, das den gewünschten Keim hemmt, kann die Reinheit der Probe überprüft werden.

• Flüssig-Flüssig mit einer Öse
  • Mit der Öse in die Kulturlösung tauchen, wobei darauf zu achten ist, dass die Impföse nicht an der Öffnung oder Aussenwand des Reagenzglases anstosst. Eine Flüssigkeitshaut muss in der Öse ausgespannt sein.
  • Einbringen des Impfgutes in die sterile Nährlösung:  
  • Die Impföse in die Nährlösung einführen und leicht schwenken.  
• Fest-Flüssig mit einer Öse
  • Wie oben, mit der Öse werden auf dem festen Nährmedium Mo aufgenommen, die anschliessend in die Nährlösung gegeben werden
• Flüssig-Fest mit einer Öse
  • Gussplattenverfahren oder Oberflächenausstrichverfahren
• Fest-Fest mit einer Öse
  • Entname mit der Öse, Ausstrich auf einem einem Schrägagarröhrchen (Schlangenlinie)

Gesamtzellzahl berücksichtigt alle (lebende und tote) Zellen. Sie wird Mikroskopisch oder mit optischer Dichte bestimmt.

Die Lebendzellzahl wird mit Kultivierungsverfahren bestimmt. Sie erfasst alle lebenden Zellen.

Die dezimale Verdünnungsreihe wird angelegt, um eine Konzentration zu erhalten, die kulturell bestimmt (bzw. ausgezählt) werden kann, bzw. eine Konzentration mit der die gewünschten Methoden sinnvoll durchgeführt werden können.

Vorgehen: Von der Stammlösung wird (nach Vortexen) ein Milliliter in ein Ragenzglas mit steriler Verdünnungslösung gegeben. Von dieser Verdünnung ausgehend wird wieder ein Milliliter in ein weiteres Reagenzglas gegeben usw. Die Verdünnungen weren der Reihe nach mit -1, -2 etc. angeschrieben.

Gussplattenverfahren:

• Petrischale am Boden beschriften
• aus der berechneten Verdünnung 1 ml Probe in die Petrischale pipettieren
• 20- 25 ml sterilen Agar (45°C) in die Petrischale giessen (nicht direkt auf die Probe)
• Petrischale vorsichtig schwenken, um MO zu verteilen
• Petrischale mit Deckel nach unten inkubieren (nach erstarren)

Oberflächenaustrichverfahren:

• Petrischale mit abgekühltem Agar benutzen
• 0.1 ml auf die Platte pipettieren
• Probe mit einem Drigalski-Spatel ausstreichen
• nach antrocknen mit Deckel nach oben inkubieren

Vorteile:

• kleinere Hitzebelastung
• einfachere Zählung
• einfachere Kolonienentnahme

Nachteile:

• nur aerobe und fak. anaerobe MO
• höhere Nachweisgrenze

Vorteile:

• tiefe Nachweisgrenze (bis 1 KBE/ml)

Nachteile:

• Hitzebelastung der MO
• Zeitintensiv
• Temp muss <50°C
• Höherer Verdünnungsaufwand
• unübersichtliche Zählung (Keime im Agar)
• Aufwendige Prüfung vom Agarmedium

• flüssige Proben (oder verflüssigte Proben, mit tween)
• tiefe Keimbelastung
• keine Feststoffe in der Flüssigkeit

• Etwa 10 g Untersuchungsgut wird mit der neunfachen Menge Dispersionsmittel vermischt und so schnell wie möglich weiterverarbeitet
• mit mechanischem Verfahren wird die Probe dispergiert (Stomacher; schonend, einfacher Transport, gute filtration etc.)
• die Lösung wird als -1 Verdünnung gehandhabt

\(N = {{\sum C} \over V*G*d}\)

N: Anzahl MO in der Probe

C: Summe der Kolonien aller Platten

V: Volumen des Inokulums

G: Gewichtung

d: Faktor der niedrigsten Verdünnungsrate (erste auszählbare Verdünnung, beginnend von der (0) bzw. -1 Verdünnung)

Die KBE auf dem Filter werden gezählt. Das Maximum an auszählbaren KBE ist dabei 150. Die KBE pro die Filtrierte Menge entspricht der Konzentration.

• nicht filtierbar Proben oder feste Proben werden mit dem MPN-Verfahren analysiert
• bestimmung der wahrscheinlichsten Keimzahl durch statistische Überlegungen
• beim MPN können 3,5 oder 10 Parallelansätze eingesetzt werden, dabei steigt die Genauigkeit
• Bei der Plattenmethode werden je drei Parallelansätze von 10 µl mithilfe einer Schablone aufgetragen (Von bis zu acht Verdünnungen)
• Auswertung erfolgt über Tabellen:
  • Anzahl KBE pro Verdünnungsreihe werden in der Tabelle verglichen
  • Kategorie muss 1 sein, damit das Ergebnis ausgewertet werden kann.
  • MPN wird angegeben mit Unsicherheitsbereich

Ergebnisse > 300/Platte:

x > 10^2 * Verdünnung letzte Platte

Ergebnisse <0/Platte

< Nachweisgrenze Verfahren (Oberflächen bsp. 10KBE/ml) * 10^1 (oder erste angesetzte Verdünnung)

Vorteile:

• rasche Ergebnisse, billig und einfach durchführbar
• gewisse Aussagen über MO-Gruppen möglich

Nachteile

• Zählung erst bei relativ hohen Zellzahlen möglich (Hefen ab e5, Bakterien ab e6)
• nur geringe Probemengen können untersucht werden
• ungleichmässige MO-Verteilung liefert falsche Aussagen
• Erfassung der Gesamtzellzahl

Vergrösserung:

• Verhältnis zwischen der scheinbaren Grösse und der wahren Grösse eines Objekts

Auflösung:

• Vermögen zwei Objektdetails im Präparat auch im mikroskopischen Bild noch getrennt darzustellen
• Bei Lichtmikroskopen maximal 0.2 µm

Kontrast:

• Unterschied zwischen hellen und dunklen Bereichen eines Bildes

1)Stativ und Grundplatte: dient als stabile Basis und verbindet die verschiedenen optischen Systeme miteinander.

2) Leuchtfeldblende: mit ihr kann das von der Lichtquelle erzeugte Licht auf- und abgeblendet, sowie zentriert werden.

3) Universalkondensor: dient der optimalen Ausleuchtung der Objektivapertur, besitzt eine Aperturblende und eine Revolverscheibe mit verschiedenen Lichtringen zur Hellfeld-, Phasenkontrast- und Dunkelfeldoptik.

4) Objekttisch: dient als Unterlage für den Objektträger. Der Objekttisch kann durch zwei Zentrierschrauben im Kreuz verschoben werden.

5) Objektivrevolver: ist in der Regel mit vier Planfeldobjektiven ausgestattet. Jedes dieses Planfeldobjektivs besteht seinerseits aus einem Linsensystem, welches ein vergrössertes Bild des zur Betrachtung vorgelegten Präparates entwirft. :

6) Okular: es vergrössert das vom Objektiv gelieferte Bild um einen Faktor 10 und wandelt es in ein virtuelles Bild um. Das Okular wirkt also wie eine Lupe.

7) Grob- und Feintrieb: dient zur Positionierung des Kreuztisches und bei gewissen Mikroskopen auch des Objektivs.

8) Lampengehäuse: es enthält die vorzentrierte Halogenlampe.

9) Rändelkopf: damit lässt sich die Lampenhelligkeit dem Präparat angepasst verstellen.

10) Zentrierschrauben: zum Zentrieren der Leuchtfeldblende.

11) Zentrierschrauben: zum Zentrieren des Phasenringes.

Hellfeldmikroskopie:

• herkömmliche Mikroskopierart, Objekt erscheint dunkel vor hellem Hintergrund
• geeignet für gefärbte Präparate oder Objekte mit starker Eigenfärbung
• Bakterien, Schimmel, teilweise Hefen

Phasenkontrastmikroskopie:

• Geeignete und für viele Zwecke angewendete Mikroskopierart
• ungefärbte Präparate und Präparate lebender, kontrastarmer MO

• Zellform
• Zellanordnung
• Beweglichkeit
• Sporenbildung (in Verbindung mit Gram-Färbeverhalten)

• Form
• Anordnung
• Beweglichkeit
• Ausbildung asexuellen und sexuellen Fruktifikationsformen (viel Erfahrung nötig)

Ausgehend von der Grobdifferenzierung eines MO kann mit der Feinidentifizierung je nach Methoden (MALDI-TOF) bis zur Spezies oder mit WGS sogar bis zum Stamm erreicht werden. Verschiedene Organismen haben jedoch sehr ähnliche Eigenschaften, wodurch sie mit den konventionellen Methoden (MALDI TOF, Fettsäureprofil usw.) teilweise nicht genau bestimmt werden können.

Die Mo müssen in Reinkulturen vorliegen und dürfen nicht zu alt sein (am besten über-Nacht Kultur). Die Stoffwechselaktivität verringert sich im Alter, weshalb verschiedene Reaktionen mit alten Kolonien schlecht oder gar nicht ablaufen.

MALDI TOF: Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time Of Flight Mass Spectrometry

• Analyse von Proteinen und Peptiden; Moleküle mit einer Grösse von bis zu einem MDa können detektiert werden
• MO können anhand ihres spezifischen Proteinprofils ihrer Gattung oder sogar Art zugeordnet
• Die Proben werden mit einem Laser beschossen und verdampfen schlagartig; die Proteine und Peptide werden ionisiert und fliegen im Vakuum in einem elektrischen Feld, wobei ihre Flugzeit detektiert wird, welche anschliessend mit Referenzwerten verglichen werden kann

Fettsäurenprofil (Sherlock System):

• Fettsäuren werden zuerst isoliert, methyliert, verestert und anschliessend im Gaschromatograf aufgetrennt
• Fettsäurenzusammensetzun ist jedoch je nach Nährmedium und Kultivierungstemp. verschieden -> wird nicht im klinischen Bereich eingesetzt

DNA-Sequenzierung:

• PCR mit anschliessendem Cycle Seq.
• Es wird oft das 16-S-Ribosomale Gen analysiert aber es sind auch andere Gene (manchmal sogar besser) geeignet

Biochemische Identifikationssysteme:

• Eine Reihe von Stoffwechselvorgängen werden gleichzeitig analysiert. Aufgrund der Grobdifferenzierung werden verschiedene Systeme eingesetzt.
  • Verwertung eines Substrates (z.B. Zucker, Aminosäure)
  • Bildung von Stoffwechselprodukten (z.B. Indol, H2S)
  • Produktion von Enzymen
  • Bildung von Pigmenten
• Es gibt verschiedene (auch automatische) Testsysteme

Elektivmedien sind Medien, die spezifisch das Wachstum einer MO-Gruppe fördern. Es enthält Substanzen, die deren Anforderungen entsprechen. Dies sind beispielsweise Glucose, Pepton oder Hefeextrakt.

Selektivmedien sind Medien, die Stoffe enthalten, die das Wachstum unerwünschter Begleitflora unterdrücken. Dadurch kann eine selektion des gewünschten Keims erfolgen. Selektivmedien können auch für den Zielorganismus eine Belastung sein. Es werden Antibiotika, Kristallviolett und Gallensalze, wie auch andere Salze eingesetzt, um unerwünschtes Wachstum zu hemmen.