Zellkulturtechnologie

Fluoreszenzfärbung der DNA mit DAPI in der Zellkultur

Nachteil: Zellkultur überlebt diese DNA-Färbung nicht, deswegen soll man eine Testkultur machen. 

Ablauf: DAPI in Methonol gelöst zugeben (inkubieren 15 min, 37 ºC), mit PBS waschen, mikroskopieren (schneller Prozess).

PCR-Detektion

Vorteil: hohe Nachweisempfindlichkeit, auch geringe Mengen von Mycoplasmen können hier nachgewiesen werden. Und sie detektieren alle bekannnten Mycoplasmen-Spezies von Säugerzellen. 

Primer bei PCR hybridisieren konservierten Regionen der 16S ribosomalen RNA im Mycoplasmengenom. Sie zerstören nicht der Kultur. 

Aus dem Kulturüberstand wird etwas Kulturmedium (100 µl) genommen, in welcher Mycoplasmen gibt. Diese wird kurz erhitzt, so dass Mycoplasmen platzen und DNA zugänglich wird, und zentrifugiert. 2 µL von Überstand dieser Lösung genügt für eine PCR-Reaktion, um spezifische Region von Mycoplasmen zu amplifizieren. DNA wird auf Gel übertragen und mit Kontrolle verglichen. 

Vorteil: Man braucht nicht viel von Zellkultur und den Zellen geht’s weiterhin gut, wenn sie negativ getestet werden.

Antibiotika, Co-Kultur mit Makrophagen 

Nachbehandlung: Klonierung der Zelllinie u. erneuter Test auf Mycoplasmen

=> Vermischung von unterschiedlichen Zelllinien oder Vermischung von unterschiedlichen Differenzierungsstadien einer Zelllinie

z.B. bei einem Differenzierungsexperimenten mit pluripotenten Stammzellen; ausdifferenzierte Zellen und Vorstadien als Kontamination im selben Kultur

=> Konkurrierung von Zelllinien um Nährstoff 

• unterschiedliche Morphologie der Zelllinien

Es kann aber auch vorkommen, dass die Morphologie der Zellen auch wegen was Anderes beeinlusst werden.

Subconfluent: Zellen können proliferieren, da es genug Platz im Zellmedium gibt. 

Confluent: Zellen können nicht proliferieren, da es nicht genug Platz gibt. In diesem Zustand kann es sein, dass die Morphologie geändert wird, da sie sich nicht mehr in dem Zellzyklus befinden und die Genexpression ändern. 

Substanzen im Nährmedium hat auch Einfluss auf die Morphologie. 

• Niedrigere Syntheserate (z.B. Hybridomzelle für die Produktion der monoklonaler Antikörper)

Deswegen ist es wichtig die Zelllinie nicht nur morphologisch als auch auf der Genebene charakterisiert wird => Authentifizierung von Zelllinien, um nachzuweisen, um welche Zelllinie sich handelt und zu sehen ob es Kreuzkontamination gibt.

• Karyotyping (chromosomale Analyse)
• Isoenzym-Analyse
• Analyse von STRs (short tandem repeats)

Klonierung identifizierter Zielzellen & erneuter Test auf Kreuzkontamination

• Versorgung der Zellen mit essentiellen Substanzen/Nährstoffe für das Überleben der Zellen
• Neutralisierung von Abfallprodukten der Zellen 
• Ersatz der Immunabwehr

• Aus Froschembryonen hat er das Neuralrohr entnommen (Vorform des zentralen Nervensystems) und auf eine Objektträger draufgelegt.
• Aus dem Forschlympe (Kulturmedium, Körperflüssigkeit von Spender)  hat er auf diesen Neuralrohr gegeben, damit es vollständig bedeckt war (Kulturmedium) und antrocken lassen.
• Dann hat er diesen Objektträger nach unten (upside down) gedreht, so dass diese Lympflüssigkeit bisschen hing. Und dann hat er es auf mulden Glas gesetzt.
• Durch Glas (Glas auf Glas) hat er es vor Kontamination geschützt.
• Er konnte Wachstum von Neuronen beobachten!

Milestones:

• Er hat ein funktionierendes Medium generiert.
• Er hat eine besondere Kulturform entwickelt => hanging-drop culture 
• Er hat eine Kulturgefäß aus Glas entwickelt, wobei er das Wachstum beobachten konnte und welche Kontamination von außen aufhält. 

• Komponenten: AS, Vitamine, Kohlenstoff (z.B. Glucose), Serum bzw. Serumersatzstoffe, Spurenelemtente, anorganische Salze, Fettsäuren, Lipide, Puffersubstanz, pH-Indikator
• Geprüfte Qualität
• Gebrauchsfertige Lösung/Konzentrat, die man mit sterilen Wasser komplementieren kann, oder als Pulvermischung (niedrige Gewicht, lange Haltbarkeit, geringe Stauram, die in Wasser gelöst wird). 

=> sorgt dafür, dass in Kulturmedium Hormone und Wachsumsfaktoren für Proliferation/Wachstum der Zellen verhanden sind. 

+ Vitamine, Anheftungsfaktore, Puffer, Neutralisierungskomponenten (Antikörper oder Serumalbumine) 

z.B. fetales Kälberserum 

=> Wenn man das Blut gerinnen lässt, dann platzen die Thrombozyten und geben die Wachstumsfaktoren ins Serum ab. 

• qualitative und quantitative Schwankungen zw. Chargen
• können Inhibitoren enthalten (z.B. Bakterientoxine)
• cytotoxischen Reaktionen durch Kombination der Inhaltstoffe von Seren mit Zellsekreten, z.B. Bildung von toxische Aldehyde durch die Anwesenheit von Polyaminoxidasen
• Seren enthalten auch Proteasen => diese soll man berücksichtigen, wenn man z.B. rekombinante Proteine produziert, man soll schauen, ob man die Proteasen beseitigen kann
• enthalten in Experimenten störende Inhaltstoffe, z.B. Antikörper in Seren bei der Produktion von monoklonaler Antikörper => mittels Affinitätschromotographie aufreinigien oder alternativ serumfreie Medien verwenden
• Quelle von Kontaminationen, z.B. TSE (Transmissible Spongiforme Enzephalopathie) 
• unerwünschte Selektionseffekte; da die Chargen unterschiedlich zusammengesetzt sind, findet unterschiedliche Formen von Selektion im Kultur statt

Selektionseffekt: Zellpopulation ist immer eine Mischung aus einzelner Zellen, die sich im Detail bisschen unterscheiden und je nach Serum Zusammensetzung kann es sein, dass nur ein bestimmter Teil dieses Subpopulation durch die Serum-Zusammensetzung gefördert wird oder aber auch Nachteile erleidet, d.h. nicht mehr so gut proliferiert wie der Durchschnitt der Population.

Dabei wird einzelne Bestandteile rekombinant hergestellt. 

• Meist ein Standardcocktails von Insulin, Transferrin, Selenit => ITS-Medien

Übergang zur serumfreie Medien: 

Wenn man vorhat, beispielsweise zu Produktionszwecken so eine Zelllinie von Serumhaltigen zur Serumfreien umzustellen, dann geht das schrittweise. 

Dieeser Umstellungsprozess, Serum rauszunehmen und Serumfreie Ersatzstoffe zuzugeben, kann mehrere Wochen dauern. Dabei reduziert man schrittweise den Anteil des Serums und dementsprechend komplementiert mit Serumersatzstoffen. 

1. Austausch von Kulturmedium 
2. Subkultur (Passagieren)
3. Wachstumskurven
4. Zellzahlbestimmung
5. Transfektion
6. Kryokonservierung

Adhärente Zellen: 

• Erstellung von Subkultur vor Eintreten der Konfluenz => so dass die Zellen noch Platz haben, zu proliferieren

Methoden:

• mechnanische Dissoziation

Es gibt Zellen, die wenig mit der Substratoberfläche von Zellkulturflasche adhärieren (keine intensive Verbindung mit Substrat). Solche Zellen kann man einfach durch Abklopfen gegen die Flasche, mit Abspülen via Pipette oder durch Abschaben (z.B. bei Makrophagen) dissozieren => schwache Bindungen wird mechanisch gelöst. 

• Proteolytische Enzyme 

Meisten Zellen gehen aber eine starke Verbindung mit dem Substrat der Flasche ein. Dabei benötigt man Enzyme, die dafür sorgen, dass die Verbindung aufgelöst wird, z.B. Trypsin. 

Suspensionskultur: 

Dabei wird ein Aliquot aus dem Zellkultur genommen und in eine neue Kulturflasche übertragen. Dabei muss man keine Zellen auflösen.

Wichtig: 

• Seneszenz wird durch häufige Subkultur/Passagieren beschleunigt (betrifft primär die diplodien normalen Zellen, nicht transformiert/immortalisiert, finite Proliferationsprozess => Telomere verkürzen sich nach jeder Zellteilung)

Seneszenz:= irreversible Wachstumsstopp der Zellen

Konfluenz ist die Belegung der gesamten Wachstumsfläche von Kulturgefäß mit Zellen (Monolayer).

Wenn die Zellen in direkten Kontakt miteinander kommen oder unter Umständen schon vorher, dann wird der Zellzyklus blockiert durch die molekularen Bremsen im Zellzykluskontrolsystem (CDKs; Cyclin-abhängige Kinasen, P53, Rb-Protein). 

Eine von diesen molekularen Bremsen ist das P53. Dieses P53 wird nicht nur aktiv bei Strangbrüchen (Einzel- oder Doppel-) der DNA, sondern das wird auch unter Stressbedingungen (z.B. Strahlung) aktiviert. Konfluenz ist auch eine Art Reiz/Stimulus, die zur Aktivierung von P53 führt, so dass die Zellen aufhören zu proliferieren. 

Rb-Protein ist auch eine molekulare Bremse. Rb-Protein und P53 wirken in unterschiedlichen Stellen im Zellzyklus. Wenn diese aktiv sind, dann hören die Zellen auf, zu proliferieren. 

Wenn diese Wachstumsstopp länger anhält, dann verändert sich die Qualität des Stoppsignals. Diese Zellen gehen unter Umständen nicht mehr in Proliferationsphase, selbst wenn sie geteilt/splitted und in unterschiedliche neue Kulturgefäße transferiert werden. Das gilt vorwiegend für diploide normale Zellen (nicht transformierte; transformierte Zellen verhalten sich unter Umständen anders). Deswegen soll das Passagieren vor der Konfluenz stattfinden. 

Ab einer gewissen Zelldichte, selbst wenn die Wachstumsfläche nicht vollständig bedeckt ist, stoppen die Zellen zu proliferieren (muss nicht unbedingt Kontakt zw. Zellen geben) => Dichtelimitierung. 

• Transmembranproteine

Cadherin zur Gewebeentwicklung (Cadherine verbinden sich => Gewebe)

Integrin zur Zellwachstum & Überleben (ECM-Rezeptor)

• Extrazelluläre Matrix (ECM)

Glykoproteine, Cytokine usw. 

• Zellen werden zuerst gewachsen (mit PBS/EDTA ohne Ca und Mg)

Damit will man erreichen, dass die ganzen Serenproteine vom Kultur entfernt sind. Denn die Serenproteine würden eine gewisse Kapazität von Proteasen, die man für Passagieren zugibt, abnehmen => Ablösen der Zellen wäre nicht so effizient. 

Keine Ca und Mg in PBS, da die Cadharine i.d.R. Ca binden und erst durch die Bindung von Ca die Verbindung zw. Zellen ausgebildet werden. Auch bei Integrine spielt Ca eine wichtige Rolle. Wenn man jetzt frisches Ca zugeben würde, dann würde man diese Cadharinverbindung und auch die Integrinverbindung stabilisieren. Man will aber das Gegenteil erreichen. 

• Nachdem waschen werden alles dekantiert (adhärente Zellen), dann man gibt Tyripsin zu. Ganze wird danach in Brutschrank gestellt. 

Cadharinverbindungen lösen sich auf (Zell-Zell-Verbindungen) und irgendwann beginnen sie, sich abzurunden => Kontakt zum Substrat der Kulturflasche wird verloren. Das weist daraufhin, auch die Integrinverbindungen zur Substratoberfläche aufgelöst sind. 

• Die aufgelösten motilen Zellen wird abgenommen und auf neue Kulturflaschen verteilt. 
• Trypsin muss man es neutralisieren, da es eine harsche Protease ist. Sonst arbeitet Trypsin weiter und die Zellen können keine Verbindungen zur Oberfläche oder zw. Zellen bilden. Trypsin wird durch Serum, welche Antitrypsin enthaltet, oder Abzentrifugieren neutralisiert werden.

Nachteile von Trypsin: relativ harsche Protease und muss neutralisiert werden. 

Alternative: z.B. Dispase, Collagenase, Proteasecocktails (Vorteil: sie müssen nicht neutralisiert werden).

Parameter: 

• Aussaatdichte (Ekim)
• Lag-Phase

Zellen bilden Kontakte zum Substrat und zur anderen Zellen aus. 

• Log-Phase

Zellen beginnen zu proliferieren. Proliferationsrate steigt immer weiter an (exponentielle Wachstumsphase). Diese Phase ist relativ gleichmäßig bis zu einem bestimmten Zeitpunkt. 

• Plateauphase

Irgendwann geht die Kurve in eine stationäre Phase über. Zellen hören auf, zu proliferieren, da es nicht mehr genügend Wachstumsfläche vorhanden ist und es zur Dichtelimitiereng kommt. 

• Population doubling time (PDT)

Unterschiedliche Zelllinien haben ganz charakteristische exponentielle Wachstumsphasen. Der charakteristische Parameter, den man hier bestimmt, ist die Zeitspanne, die ein Zellkultur braucht, um die Anzahl der Zellen zu verdoppeln. 

• Saturation density 

Kurz vor Erreichen von Sättigungsphase, vor Dichtelimitierung, sollte man Zellen passagieren.

• Vitalfärbung 

Zellen werden abgelöst (adhärente Zellen) und in Kontakt mit einem Farbstoff gebracht, welche i.R. geladen ist oder/und relativ groß (Molekulargewicht > 200), z.B. Trypanblau => So ein Farbstoff kann intakte Zellmembran nicht passieren, sondern nur die defekten Zellen. Dieser Farbstoff führt zur Färbung der Zellen. 

Damit kann man diskriminieren zw. den Anteil von vitalen und toten Zellen im Zellkultur. 

Alternativ gibt es Fluoreszenzfarbstoffe, die in intakte Zellen aufgenommen werden können und im Cytosol zu einer fluoreszierendes Substrat metabolisiert werden. 

• Hämocytometer (Zellkammer) 

Auf der Mittelsteg befindet sich ein gravierte Netzstruktur. Diese Netzstruktur hat eine definierte Fläche. In dem Mittelsteg hat man auch ein bestimmtes Flüssigkeitsvolumen (da der Mittelsteg niedriger als Stege an Randen sind). Somit kann man aus diesen Volumen hochrechen, wie viel Zellen im Suspension vorhanden sind. 

• Elektronische Zellzählung 

Dieses Gerät hat eine Kapillare mit Mikropore (an der Pore liegt eine Spannung an), die in Kulturgefäß riengeht. Durch diese Mikropore werden die Zellen hochgezogen. Und jedes Mal, wenn eine Zelle diese Messpore passiert, dann ändert sich die Spannung, die hier angelegt ist, da die Zelle beim Passieren kurzfristig ein Widerstand liefert. Jede Passage führt zur Eindrungen von Spannung, welche letzendlich aufgenommen werden kann. 

• CMOS Mikroskop 

Zellenzahl kann man dabei direkt im Inkubator in Echzeit messen. Zellkulturgefäß wird direkt auf dem Mikroskop gestellt. Oben gibt es eine LED-Lampe und unten gibt es ein Photosensitiven Sensor. Da, wo sich die Zellen sich befinden, wird Lichtstrahl entpsrechend gestreut, da ensteht ein bestimmtes Muster und Aktivierung von Sensor. Diese Sensor nimmt diese Daten auf und transformiert in ein Zell ähnliches Bild. 

=> für Zellzählung, die Charakterisierung der Zellen und Zellpopulationen differenziert zu analysieren oder Zellpopulationen physisch zu separieren (Subpopulationen rausholen) 

Suspension aus Zellen wird hergestellt. Dann verbindet man diese Suspension mit FACS-Gerät. In dieser Gerät werden sie mit einer dünnen Leitung durchgeschoben. In der Leitung kommt ein Laserlicht auf die passierten Zellen. Jede einzelne Zelle im Suspension erzeugt ein Signal (Lichtbrechung/Streuung) und diese wird aufgenommen/analysiert. Danach wird entschieden, ob die Zelle noch aufgeladen (elektrostatisch mit einer Ladung versehen) wird oder nicht und wie sie geladen wird. Diese elektrische Lademechanismus setzt man nur ein, wenn man die Zellen sortieren will. Am Ende dieser Fluss der einzelnen Zellen werden ein Tropfen abgebrochen und in jedem Tropfen befindet sich eine Zelle. Diese Tropfen ist entsprechend positiv/negativ geladen oder gar nicht geladen. Dann fallen diese Tropfen zw. geladenen Platten (elektrisches Feld dazwischen) und je nach Aufadung werden diese entsprechend abgelenkt in diesem elektrischen Feld oder wenn sie nicht geladen sind, dann fallen sie geradeaus durch (Sortiereinheit). 

• Forward Streuung (FSC)

=> steht für die Zellgröße

Je größer die Zelle, umso höhere FSC-Signale (weiter rechts) haben sie.  

• Side Streuung (SSC) 

=> für die Analyse der Granularität, die z.B. durch amorphe Zellkerne entstehen kann

Je granulärer die Zellen sind, desto höhere SSC-Signale haben sie (umso weiter oben). 

Beide haben ihre eigene Sensoren. Somit kann man unterschiedliche Subpopulationen definieren (Gating), z.B. weiße Blutzellen.  

FACS-Gerät weist auch Fluoreszenzdetektoren => für weitere Identifizierung der Subspopulationen

FACS ist auch mit Fluoreszenzdetektoren ausgerüstet (FL1, FL2 => detektieren grün und rot fluoreszierende Zellen). Wenn man Subpopulationen weiter differenzieren wollen (z.B. unterschiedliche Oberflächenmarkern von Lymphozyten). Dafür kann man die Zellen vor FACS mit Antikörper (B- oder T-Zell spezifisch) vorinkubieren und diese Antikörper sind konjugiert mit einem grün oder rot floureszierenden Pluophor. Neben Größe und Granularität erhält man auch die Information über die beiden unterschiedlichen Oberflächenmarkern in Zellkulturpopulation.

Einbringen von Fremd-DNA oder RNA in tierische und teilweise auch andere eukaryotische Zellen

Transfektion mit einer Plasmid:

• Carrier-vermittelte Integration d. DNA

Positiv geladene Trägermoleküle, z.B. Liposome wird mit DNA gemischt  (DNA-Carrier-Agregate => Trägermoleküle kompensieren die negative Ladung der DNA so, so dass sie mit Plasmamebran in Kontakt kommen können) und in Zellkulturmedium gegeben.

Träger-DNA-Komplexe binden an Zellmembran und von der Zelle aufgenommen (via Endocytose) 

Manche Endosomen werden proteolytisch gespalten. Andere brechen auf und schaffen sich von Endosom zu freien => werden in Cyotosol frei => DNA wird zersetzt, wenn die Bedingungen günstig sind, dann bleiben kleine Reste übrig und diese schaffen ins Nukleus => diese Reste wird transfeziert und ganz selten wird es ins Genom integriert

• Direkte Integration d. DNA

Nucleofection: Dabei wird DNA direkt in Nukleus transportiert. Dabei ist das verwendete Puffer auf die einzelnen Zellen abgestimmt. Durch diese spezifische Abstimmung hat man deutlich höheren Anteil an Plasmiden, die direkt in Zellkern gelangen, auch für die teilungsfaule Zellen geignet, da die Plasmide keine Zellteilung brauchen, um in den Zellkern zu gelangen.

Electroporation: Elektrisches Feld zerstört kurzzeitig das Membran =>  führt zur Bildung einer Pore in Plasmamembran => Plasmide gelangen in die Zelle, relativ viele Zellen zugleich kann transfiziert werden

Biolistics: DNA-beschichtetes Partikeln werden in die Zelle geschossen  => viel mehr Zellen transfiziert, als bei anderen Methoden, viele Zellen überleben aber sowas nicht

Microinjection, Transduktion (via Viren)

Transfektion mit siRNA (Knockdown-Experiment):

Sie hybridisieren an komplementaere RNA-Stränge und führen zur RNA-Abbau oder Inhibition von Translation. 

Transfection mit mRNA:

mRNA wird in die Zelle eingebracht und wird durch Ribosom translatiert, so dass man direkt ein Proteinprodukt bekommt. 

Transfection mit Proteine:

Proteine wird in die Zelle eingebracht, die in der Zelle direkt ihre Aktivität ausüben

Plasmid wird in die Zelle eingebracht, Protein wird exprimiert (ectopische Expression) für eine kurze Zeitraum. Ab irgendwann stoppen die Zellen dieses Protein zu exprimieren, da die Fremd-DNA abgebaut wird. Plasmid wird direkt abgebaut oder verdünnt sich über die Zellteilung aus (Plasmid vermehrt sich nicht). 

Bei einer transienten Transfection hat man unterschiedliche Expressionsraten von dem Zielgen, da manche Zellen gar kein, viel von oder wenige von dem Plasmid erhalten => heterogene Zellpopulation.

Vorteil: überschaubar, geht schnell 

Gen, das man exprimieren will, wird dabei stabil in Genom integriert, d.h. bei einer stabile Transfection wird das Gen auch auf die Tochterzellen übertragen, da es im Genom integriert ist. 

Nachteil: Dabei entsteht heterogene Population (nur ein Bruchteil der Zellen machen die Integration ins Genom). 

Im Anschluss versucht man zu identifizieren, welche Zellen transfeziert sind und versucht diese Zellen zu isolieren, z.B. über Resistenzmarker oder Fluorophore. Aus diesen isolierten transfizierten Zellen versucht man eine Zellpopulation aufzubauen. Diese Zellpopulation ist dann homogen (=> in jeder Zelle wird das Zielgen exprimiert). 

Nachteil: Dieser Prozess dauert sehr lange (über Wochen, Monate).

• Geringe Transfektionseffizienz

=> wenn keine Optimierung stattfindet

• Exzessive Zelltod

Ursachen: zu viel DNA/Plasmid in der Zelle

Übermäßige Exposure mit den Transfektionskomplexen => Wenn sowas passiert: Kulturmedium bald wechseln, verbleibende Trägermoleküle rausnehmen, so dass diese beseitigt sind. Plasmidkomponenten werden von Zellen nicht so gut vertragen.

• Variable Transfektioneffizienzen in wiederholten Experimente

=> sehr häufig & hat Einfluss auf die Schlussfolgerung von Experiment

Ursachen: Inkonsistenz der Zellkonfluenz in wiederholten Experimente & Mycoplasmakontamination (hat Einfluss auf Effizienz) & Verwendung von Zellen mit höheren Passageanzahl & Serumvariabilität

• Langzeitspeicherung
• Zwischenstadien eines Experiments einfrieren
• Anlegen von Sichheitskopien (Master stock & working stock)

Ablauf: 

Kulturmedium wird aus Zellkulturgefäß dekantiert. Dann wird die Zellen trypsiniert, so dass sie von Unterlage abgelöst werden. Dann werden die Proteasen abzentrifugiert. Zellen werden danach in einem Gefahrschutzmedium (enthält Glycerin oder Dimethylsulfoxid + hohe Anteil an Serum) resuspendiert. Schutzsubstanzen verhindern bei der Einfrieren von Zellen sich Kristallwasser (Eiskritalle) in der Zellen bildet, was zur Verletzung von zelluläre Membrane führt. Diese Schutzsubstanzen binden zelluläre Wasser, so dass sie keine Eiskristalle bilden. Dann werden die Zellen eingefroren.

Kultur von Zellen, Geweben u. Organen in vitro, die direkt aus Organismus entnommen wurden. 

Varianten: Zell-, Gewebe-, Organkultur

• wird oft als Übergangsphase verwendet, um anschließend Zelllinien zu entwickeln. 
• kann aber auch selbst Kulturziel sein. 
• besitzen am ehesten die Eigenschaft von Zellen, wie man sie in vivo findet => näher an in vivo-Verhältnissen als Permanentlinien. Somit kann man aus Primärkultur bessere oder belastbarere Rückschlüsse auf in-vivo ziehen. 
• nur ein Kurzzeitexperiment wird gemacht und man will Zellen nicht über Wochen/Monate kultiveren
• keine passenden Permanentlinien verfügbar

• Auswaschen von Isolaten

Man nimmt kleines Gewebstück von diesem Organ und setzt dieses Gewebstück auf eine Petrischale und überschichtet es mit Kulturmedium. Wenn man Glück hat, dann wachsen aus diesem Isolat einzelne Zellen. Wenn diese Einzelzellen die Zielzellen sind, die man isolieren will, dann werden diese Zellen abgeschabt und in neues Kulturgefäß übertragen. 

• Mechanische Dissoziation 

Kleines Gewebstück aus dem isolierten Organ wird herausgeschnitten und diese wird durch Skalpell zerschnitten, dann mit Sieb gedrückt. Diese Siebe haben kleine Pore, so dass nach und nach dieses Gewebe sich auflöst. Am Ende kann man es z.B. mit Spitze aufziehen und somit werden die restlichen Zell-Zell-Verbindungen aufgelöst. 

• Enzymatische Dissoziation

Es gibt verschiedene Proteasen zur Auflösen von Verbindungen (z.B. Trypsin, Collagenase, DNAase usw.). Wenn die Proteasen ein Isolat auflösen, dann bekommt man eine hochviskose Lösung (schleimartig, nicht wässrig), da bei der ganzen Isolierung von dem Gewebstück manche Zellen verletzt wurde und die DNA freigesetzt wurde. Diese DNA führt dazu, dass die Zellen trotz Auflösung der Verbindungen mittels Proteasen miteinander zusammenhängen. Deswegen wird es dabei DNAase zugegeben, um diese freigesetzte DNA noch aufzulösen. Dann bekommt man Einzelzellen. 

Ziel bei Primärkultur: möglichst viele vitale Zellen (möglichst gering geschädigte Zellen) bekommen

Wichtig:

• aseptische Präparation
• Entfernung von Proteasen
• hohe Aussaatdichte 
• fetales Gewebe => kann besser dissoziieren, mehr vital, mehr proliferieren

Beispiel: Lymphozyten

• Blut von Donor mit Heparin aufziehen

Heparin verhindert die Gerinnung von Blut und Verklumpung der Blutzellen. 

• Anschließend wird das Ganze mit Dextran vermischt

Dextran bindet selektiv an verschiedene Formen der Blutzellen => spezifische Gewicht der roten Blutkörperchen erhöht

• Rote Blutkörperchen werden sedimentiert (mit 1 g) und Überstand abgezogen 

=> so dass die rote Blutkörperchen raus sind. 

• Anschließend wird eine Dichtegradientenzentrifugation gemacht

=> um die unterschiedliche Blutzellen im Überstand nach Ihrer Dichte zu separieren (Plasma, Monocyten/Lmyphocyten/Thrombocyten, Erythrocyten/Granulozyten) 

• Schicht in der Mitte mit Monocyten, Lymphocyten und Thrombocyten wird isoliert 
• Zellen werden gewaschen und zentrifugiert, Thrombocyten bleiben im Überstand
• Rückstand wird in Kulturmedium aufgenommen 

Lymphocyten sind im Kultur nicht teilungsfreudig, deswegen gibt man in dieser Phase der Primärkultur unterschiedliche Mitogene zu (z.B. Phytohämagglutinin; wirk auf Lmyphozyten mitogen).

Aufbau:

• Antikörper ist gegen Oberflächenantigen gerichtet. 
• Antikörper sind mit einem paramagnetischem Partikel verbunden => werden magnetisiert, wenn sie sich innerhalb eines Magnetfelds befinden, wenn nicht, werden sie nicht magnetisiert. 
• In 3 Formen kann diese Komplexe vorkommen:

Spezifische Antikörper ist direkt mit paramagnetisches Partikel verbunden.

Primär-Antikörper, der das Epitop der Blutzelle erkennt, ist über seine konstante Bereiche an einen anderen Antikörper verbunden, der mit paramagnetisches Partikel verbunden ist.

Tetramere Verbindung von Primär-Antikörper, der ans Epitop bindet, und andere Antikörper, welche mit seinem Paratop an ein paramagnetisches Partikel bindet (Vorteil: Paratope der Antikörper werden hier nicht verändert => höhere Selektivität). 

• Art des Magnetpartikels kann sich auch unterscheiden. Je größer das Magnetpartikel ist, umso geringer muss das Magnetfeld sein, das anwendet. 

Ablauf: 

• Blutzellen werden mit den Antikörper und paramagnetische Partikel inkubiert, so dass sie zusammen Komplexe bilden. 
• Diese Zellen werden dann über eine Säule gegeben und die Säule ist ein Magnetfeld ausgesetzt.
• Die Zellen, die Komplexe mit Antikörper und Magnetpartikel gebildet haben, werden im Durchfluss zurückgehalten. Alle nicht markierten Zellen fließen durch. 
• Man nimmt die Säule mit verbliebenen spezifisch markierten Zellen aus dem Magnetfeld und eluiiert diese. 

2 Konzepte bei der Immunmagnetseparation:

• Positiv-Selektion: Man markiert mit Primärantikörper die Zielzellen, die man haben möchte und über den Magnet dann zurückgehalten werden. 
• Negativ-Selektion: Man kann auch alternativ die nicht-Zielzellen markieren. 

Immunzellen sind sehr empfindlich gegen Interaktionen mit ihrer Oberfläche insbesonders mit Antikörper und dabei kann es auch zur unerwünschten Reaktionen kommen. Deswegen wird Negativ-Selektion bevorzugt.

=> Wenn die Zellen nicht in mehreren Schichten aneinander gelagert sind, sondern wenn diese Gewebschichten größer, aber trotzdem inhomogen sind. 

Dabei will man z.B. die mittlere Zellpopulation isolieren. Dafür verwendet man Lasermikrodissektion. Dazu braucht man ein Mikroskop mit Zusatzausstattung von Lasermikrodissektion. 

• Präparat wird auf Mikroskoptisch gelegt. 
• Unter Mikroskop kann man das Bereich markieren, die man ausschneiden/isolieren lassen will. 
• Danach schneidet der Laser entlang der vorgezeichneten Linie das Gewebe aus (sehr genau).
• Dann wird dieses ausgeschnittene Präparat mit einem kurzen Laserpuls hochkatapultiert/rausgeschossen und mit einer Eppendorf-Tube aufgefangen (berührungslose Transport in das Auffanggefäß => Mikrodissektat hebt sich vom Träger ab und fliegt ins Cap). 
• Danach wird dieses Gewebe in Kultur gebracht. 

• Standardprotekolle sind meist supoptimal

Optimierung der Protekolle und der Medien durch Supplemente, Zellspezifika beachten. 

• Geringe Vitalitätsrate

Je stärker die Gewebsverbindungen sind, umso geringer wird hinterher die Vitalitätsrate des Primärkulturs, da man extrem harsche Bedingungen anlegen muss, um die Zellen zu vereinzeln. Da bietet sich an, vor dem Einsehen, die geschädigten Zellen vor dem Aussaat mittels Zentrifugation zu entfernen, so dass sie das Wachstum der vitalen Zellen nicht beeinträchtigen. 

=> sehr hohe Aussaatdichte nötig, da viele Zellen im Laufe der Dissoziation geschädigt werden. 

• Zellen bleiben in Suspension, obwohl sie z.B. adhärent wachsende Zellen sind 

Dabei kann man ECM-Motive auf den Substrat des Kulturgefäß anbringen, z.B. RGD-Motiv, die mit der Integrine der Zellen integrieren. Oder man beschichtet das Gefäß der Primärkultur mit Zellen, die wachstumsarretiert sind und die Substratoberfläche bedecken. Diese Zellen liefern Zellkontakte für die Primärkultur und mitogene Substanzen (Feeder-Layer).  

• Falsche Zellen gehen an (Selektionseffekte)

Wenn man die Zielzellen nicht so gut separieren konnte, unter den Bedingungen von Primärkultur proliferieren nicht die Zielzellen, sondern andere Zellen. Da gibt’s genügend andere Zellen, die besser mit Kulturbedingungen zurechtkommen, als die Zielzellen, z.B. Fibroblasten, welche sehr schnell adhärieren. 

Bei der gemischte Kultur lässt man die Fibroblasten adhärieren, bevor andere adhärieren können, wird gleich der Überstand entfernt mit den nicht adhärierenden Zellen. Diese wird dann auf ein weiteres Kulturgefäß gegeben. 

• Kontamination (vorzeitige Trübung des Mediums)

*bei der Isolierung und Dissoziation der Zellen kann es zur Kontaminationen kommen

=> regelmäßig täglich die Kultur auf Kontamination kontrollieren, so dass man schnell möglich es beseitigen kann.

Inkubationskammer für ein Fragment, die von Perfusionslösung durchgespült wird und die Abgabelösung der Zellen kann analysiert werden (Fragment wird in der Mitte eingesetzt). 

=> Danach Zellen aus dem Gewebe isolieren und auf Primärkultur bringen.