Einführung in die Biotechnolgie (Tutorium)

• Materialien, mit denen gelöste Ionen durch andere Ionen gleichnamiger Ladung ersetzt werden können

• Die auszutauschenden Ionen werden am Austauschermaterial gebunden, das seinerseits eine äquivalente Stoffmenge vorher gebundener Ionen in die Lösung abgibt.

→ Anionenaustauscher: • Negativ geladene Moleküle binden an positiv geladene Materialien

→ Kationenaustauscher: • Positiv geladene Moleküle interagieren mit einer negativ geladenen Matrix Anwendung,

z.B. bei der Isolation von Plasmid-DNA

• Restriktion von Vektor und Insert zur Vorbereitung der Ligation

• Kontrollverdau/Restriktionsanalyse: Zerschneiden eines Plasmids zur Überprüfung der Integrität und Reinheit des Plasmids

→ Überprüfung der Fragmentgrößen durch Agarosegelelektrophorese

• Kompetenz = Fähigkeit, DNA aus der Umgebung aufzunehmen

• Relevant für das Einfügen von Fremd-DNA in Organismen

• Natürlich kompetente Zellen • Elektrokompetente Zellen: Für Elektrotransformation geeignet (salzfrei!)

• Chemisch kompetente Zellen: Geeignet zur Transformation durch Hitzeschock (zuvor Behandlung mit zweiwertigen Kationen)

• Die DNA-Topoisomerase ist durch eine kovalente Bindung direkt an den Klonierungsvektor gebunden, sodass das DNA-Fragment sofort mit dem Vektor ligiert werden kann, wenn es sich an die passenden Stellen angelagert hat (→ Nur 2 Moleküle müssen „sich finden“).

• Taq-Polymerase hängt A-Überhänge an 3‘-Ende des Inserts an, welche mit den T-Resten am 5‘-Ende des Vektors hybridisieren

• Bei der klassischen Ligation (DNA-Ligasen) müssen sich 3 Moleküle finden: Der Vektor, das DNA-Fragment und die Ligase. Die räumliche Nähe der Topoisomerase ist hier also der entscheidende Vorteil, da zwei Partner bereits in räumlicher Nähe verortet sind.

• Außerdem entfällt die Restriktion des PCR-Produkts (fehleranfällig). 

TOPO und Gateway sind eingetragene Warenzeichen der Firma Thermo Fisher Scientific.

Klonierungsvektoren sind auf die DNA Vermehrung optimiert, Expressionsvektoren auf die Proteinexpression

Expressionsvektoren:

• MCS: multiple cloning site

• Antibiotika-Resistenz

• Origin of replication

• Promoter

• Ribosomenbindestelle/Shine-Dalgarno-Sequenz

• Startcodon

• ggfs. His-Tag o. ä.

Klonierungsvektoren:

• MCS: multiple cloning site

• Antibiotika-Resistenz(en)

• Origin of replication

• ggfs. Doppelselektionssystem wie Gen zur Blau-weiß-Selektion

1. Enzym produzieren, welches das Antibiotikum abbaut / zerschneidet. Beispiel: b-Lactamase

2. Antibiotikum über Transporter aus der Zelle schleusen Beispiel: Effluxpumpe TetA

3. Anbindung des Antibiotikums an Zielstruktur durch Modifikation verhindern Beispiel: Aminophosphotransferase oder Chloramphenicolacetyltransferase

• Directed Evolution • Vielfaltsgenerierung mittels meist ungerichteter Mutagenese

Auswahl verschiedener Mutageneseverfahren (oft ungerichtet) zur Vielfaltsgenerierung; Anlegen von Klonbibliotheken; Screening auf neue, gewünschte Eigenschaften.

• Rational Design • Gezieltes Erschaffen der gewünschten Eigenschaft durch gerichtete Mutagenese

Gezieltes Erschaffen von gewünschten Eigenschaften durch Kombination von theoretischen und praktischen Methoden. 

gerichtete Mutagenese

1. Plasmidisolation / -präparation (inkl. Aufreinigung des Plasmids)

2. Temperature Cycling / PCR (Denaturierung des Templates, Annealing und Verlängerung mit spez. mutagenen Primern)

3. Digestion / Verdau (Abbau des methylierten DNATemplates mit DpnI, keine Ligation)

4. Transformation (Plasmid mit Mutation wird in die Wirtszelle eingebracht und „Nicks“ werden durch die Wirtszelle repariert)

Hinweis: Die Template-DNA kann nur deshalb selektiv abgebaut werden, weil sie im Gegensatz zum neu entstandenen PCR-Produkt methyliert ist. 

• Die Polymerase weist beim Einbau von falschen Nukleotiden eine starke Bevorzugung (engl. bias) auf: Etwa 63% der Mutationen sind Transitionen von T → C und A → G

• Durch die Organisation des genetischen Codes sind einige Aminosäuren deutlich bevorzugt (z.B. Ala, Ser vs. Trp, Met)

• Beim Austausch der letzten Base in einem Triplett wird u.U. die gleiche Aminosäure erhalten („Wobble Basenpaarung“). Einige Aminosäuren können gar nicht durch einen einzigen Basenaustausch in einander umgewandelt werden (z.B. Gly zu Met)

• Methoden der ungerichteten Mutagenese

• UV-Strahlung (durch Thymin-Dimere entstehende Läsionen müssen repariert werden, wobei Fehler entstehen können)

• Chemische Methode, bsp. Desaminierung mit Salpetersäure (Adenin wird zu Hypoxanthin umgewandelt, welches mit C statt mit T paart)

• epPCR (Fehleranfällige PCR)

• Methoden der gerichteten Mutagenese

• „Overlap extension“ PCR (Einfügen einer Punktmutation über Primer, welche die gewünschte Mutation tragen, in drei PCR Schritten)

• Quikchange Methode (Einfügen einer Punktmutation über Primer, welche die gewünschte Mutation tragen, wobei die Ursprungs-DNA eliminiert wird)

• Kettenabbruchmethode

• PCR mit zusätzlichen Didesoxynukleotiden (ddNTP), die unterschiedliche Fluoreszenzmarker tragen.

• Wenn ein ddNTP eingebaut wird, kann der Strang nicht weiter verlängert werden

→ Abbruch der Kettenverlängerung!

• Folge: Es werden Fragmente unterschiedlicher Länge erhalten

→ Idealerweise gibt es für jede Stelle der Sequenz Fragmente, die markiert sind.

• Kapillarelektrophorese mit Laserdetektor, der die Fluoreszenz der Fragmente erkennt

→ Kurze Fragmente wandern schneller, längere Fragmente langsamer → Fragm

ente werden ihrer Größe nach aufgetrennt und können anhand der Fluoreszenzmarkierung erkannt werden.

• Restriktionsanalyse mit anschließender Gelelektrophorese

• Colony-(Check-)PCR

• Southern Blot

• Test-Expression

• DNA sequencing

• (Blau-Weiß-Selektion)

• Dient der Überprüfung, ob ein Insert in den Vektor eingefügt wurde

• LacZ: Teil des Lac-Operons, der für das Enzym β-Galactosidase kodiert. Das Enzym spaltet Lactose zu Glucose und Galactose bzw. X-Gal zu Galactose und einem blauen Farbstoff.

• -Komplementierung: Inaktive b-Galactosidase in E. coli wird durch Fragment des LacZ-Gens zu aktivem Enzym komplementiert.

• Multiple cloning site (MCS) liegt innerhalb des LacZ‘-Gens auf dem Vektor. Beim Einfügen des Inserts in den Vektor wird das LacZ‘-Gen unterbrochen. → β-Galactosidase inaktiv → Weiße Kolonien (kein Farbstoff)

• Blaue Kolonien = β-Galactosidase aktiv → Insert wurde nicht eingefügt, da das lacZ‘-Gen intakt ist.

Batch

- Anfängliches Befüllen des Fermenters, kein Hinzufügen oder Entnehmen von Medium während des Fermentationsprozesses (Ausnahme: O2 )

Beispielprodukt: Enzyme

Fed-batch

- Ähnlich dem Batch-Betrieb, jedoch kontinuierliche Substratzugabe während des Prozesses Beispielprodukt: Backhefe 

Kontinuierlich

- Kontinuierliche Substratzugabe und Produktentnahme während des Prozesses Beispielprodukt: Insulin 

A: Biomasse S: Substrat P: Produkt

A: Biomasse; S: Substrat; P:Produkt

A: Biomasse S: Substrat P: Produkt

→ Temperierung eines Reaktors geschieht über die Oberfläche (z.B. über Kühlmantel)

→ Bei zunehmender Reaktorgröße wird das Oberfläche-Volumen-Verhältnis immer schlechter.

→ Die Temperierung über die Oberfläche wird mit zunehmender Reaktorgröße immer schwieriger!

Chemostat

Durch Einstellung der Durchflussrate, also durch das Zudosieren des limitierenden Substrates, wird ein stationärer Zustand in der Kultur erzeugt.

Kurz: Konstante Durchflussrate, Steuerung

Turbidostat

Konstanthaltung der Trübung im Medium (≙ Biomasse-Konz.) durch Regelung der Durchflussrate. Trübung wird gemessen und anhand dieses Signals die Durchflussrate reguliert.

Kurz: Konstante Biomasse-Konz. im Reaktor, Regelung

• Schaumbildung verringert den Gasaustausch

→ Eventuell noch stärkere Sauerstofflimitation

→ Schlechteres Wachstum

• Lösung: mechanische oder chemische Antischaummittel 

• Verbesserung der Sauerstoffversorgung durch:

-Andere Rührertypen,

-stärkere Begasung,

-höhere Rührerdrehzahl,

-Erhöhung des Sauerstoffanteils in der Gaszufuhr

Oxygen transfer rate = Sauerstofftransferrate 

• Upstream

= Alle Prozesse, die zur biologischen Produktion des Zielprodukts in seiner rohen Form beitragen. Kommt es zur Ernte der biologischen Kultur beginnt das Downstream Processing.

• Downstream

= Biomasse, Produkt und andere Komponenten aus dem Upstream Processing werden weiterverarbeitet und voneinander getrennt, um das Zielprodukt in einer gewünschten Reinheit oder Qualität zu erhalten. Zum Downstream Processing gehören unter anderem …

• Zellabtrennung → Zellaufschluss → Feststoffabtrennung

• Produktisolation

• Aufkonzentrierung

• Hochaufreinigung

• Produktformulierung

Die Aufreinigungskosten sind abhängig von …

• Anzahl der benötigten Prozessschritte

• Benötigte Geräteausrüstung, Chemikalien, Personalkosten

• Produktkonzentration zu Beginn der DSP-Prozesse:

→ Niedrig konzentrierte Produkte müssen aufkonzentriert werden.

→ Hohe Arbeitsvolumina erfordern höheren Durchsatz

• Produktverlust während des DSP

• Benötigte Reinheit oder Aktivität (Enzymen)

Wahl der Zellaufschlussmethode ist abhängig von …

• Zelltyp (stabil/sensibel)

→ Sensibel Tierische Zellen < pflanzliche Zellen < gram negative Bakterien < gram positive Bakterien < Hefen < bakterielle Sporen stabil

• Produktart (empfindlich/robust)

→ Hitzeentwicklung, oxidativer Stress, Scherkräfte, abbauende Enzyme

• Kosten

• Durchsatz

• Das Arbeitsvolumen wird reduziert!

• Ein geringeres Volumen spart Kosten in nachfolgenden Prozessschritten

→ Geräte und Apparate können kleiner ausgelegt werden

→ Es müssen weniger Materialien oder Zusatzstoffe eingesetzt werden

Beispielmethoden:

• Ultrafiltration

• Fällung

• 2-Phasenextraktion

• Destillation

• Eindampfen

→ Immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC)

• Auf der stationären Phase (Silica-Material) werden Ni2+ Ionen präsentiert.

• Histidin-Seitenketten des Zielproteins komplexieren Ni2+ Ionen.

• Zielprotein wird durch Zugabe von Imidazol wieder verdrängt.