Einführung in die Biotechnolgie (Tutorium)
WS 2018/2019 RWTH Aachen
WS 2018/2019 RWTH Aachen
Fichier Détails
| Cartes-fiches | 136 |
|---|---|
| Langue | Deutsch |
| Catégorie | Biologie |
| Niveau | Université |
| Crée / Actualisé | 06.03.2019 / 26.05.2019 |
| Lien de web |
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| Intégrer |
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Was bedeutet mikroaerophiles Wachstum im Bezug auf Mikroorganismen?
• Einige Mikroorganismen benötigen einen ganz bestimmten Sauerstoffpartialdruck bzw. eine bestimmte Sauerstoffkonzentration zum Wachstum.
• Dieser liegt deutlich unter dem Sauerstoffgehalt (ca. 20%) von Luft.
Wie läuft eine Gram-Färbung von Mikroorganismen ab? Welche Informationen liefert diese über die Beschaffenheit der mikrobiellen Zellwand? Nennen Sie für jeden Zellwandtypen 2 bakterielle Vertreter.
1. Fixieren der Mikroorganismen auf Objektträger
2. Anfärben mit Kristallviolett
3. Zugabe von Iod
4. Waschen mit Ethanol
5. Gegenfärben (z.B. mit Fuchsin oder Safranin)
• „Anfärbbarkeit“ gibt Aufschluss über die Zusammensetzung der mikrobiellen Zellwand:
→ Grampositive Organismen: Eine Membran, die durch mehrschichtiges Peptidoglykan stabilisiert wird. Lipoteichonsäuren als Membrananker.
→ Gramnegative Organismen: Cytoplasmamembran von einer dünnen Peptidoglykanschicht eingefasst, die wiederum von einer äußeren Membran abgeschlossen wird. Die Oberfläche ist von Lipopolysacchariden bedeckt.
GRAM+ Bacillus, Clostridien, Staphylokkoken, Streptococcen, Listerien
GRAM- Eschericia, Pseudomonaden, Salmonellen, Pasteurella
Beschreiben Sie den Stoffwechsel von S. cerevisiae! Skizzieren Sie die zugehörigen Stoffwechselwege unter Berücksichtigung der Reduktionsäquivalente und der beteiligten Enzyme! Unter welchen Bedingungen laufen die einzelnen Reaktionen ab?
• pO2 > pO2krit, Zuckerkonz. < 0,02%: Atmung
• pO2 > pO2krit, Zuckerkonz. > 0,02%: aerobe Gärung (Crabtree-Effekt)
• pO2 = 0: Gärung
Was versteht man unter der Bezeichnung „Crabtree-Effekt“? Bei welchem Organismus wird er beobachtet?
• Obwohl genug Sauerstoff zur Verfügung steht, bildet S. cerevisiae bei hohen Glucosekonzentrationen zusätzlich Ethanol („aerobe Gärung“).
• Es handelt sich hierbei um eine Art „Überflussmetabolismus“.
→ Die Kapazität der Atmungskette reicht nicht aus, um die gesamte aufgenommene Glucose zu verstoffwechseln. Es kommt zur Bildung von Ethanol durch Gärung.
Grüne Pflanzen gewinnen Energie durch die Absorption von Licht. Während der Photosynthese wird CO2 reduziert und in Form von Kohlenhydraten wie beispielsweise Glucose fixiert. Als Elektronendonator dient Wasser. Wie werden Pflanzen anhand ihres Energiegewinns eingeordnet?
• Licht als Energiequelle (Photosynthese) → phototroph
• Die Elektronen zur Reduktion oxidierter Verbindungen liefern anorganische Moleküle, bei Pflanzen ist dies ausschließlich Wasser. → lithotroph
• Das Wassermolekül wird mit Hilfe der Energie des absorbierten Lichtes gespalten und die Elektronen zur Reduktion der anorganischen Kohlenstoffquelle CO2 genutzt. → autotroph
Zusammengefasst: Photolithoautotroph
Aus welchem Grund sind Extremozyme interessant?
→ Enzyme, die auf extreme Bedingungen (hohe oder niedrige Temperaturen, saure oder basische pH-Werte, nicht-wässriges Milieu, …) angepasst sind.
→ Kandidaten für Anwendungsfelder, in denen diese Bedingungen vorliegen.
→ Waschmittel (Temperatur, pH-Wert), Taq-DNA-Polymerase (Temperatur), …
Beschreiben Sie kurz den Aufbau des Peptidoglykans!
• Rückgrat bestehend aus N-Acetylglucosamin (NAG) und N-Acetylmuraminsäure (NAM)
• Über glykosidische Bindungen verknüpft.
• Quervernetzung über Oligopeptidketten zwischen den NAMMolekülen
Was sind die Hauptbestandteile einer Zelle? Welcher Stoff macht den größten Anteil aus?
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Was bedeutet Glykosylierung? Bei welchen Zelltypen ist sie von Bedeutung? Wo in der Zelle findet sie statt?
• Anheftung von Zuckerbausteinen an den Seitenketten von Asparagin (N-Glykosylierung) oder Serin/Threonin (O-Glykosylierung)
• Dies ist besonders in eukaryotischen Zellen von Bedeutung!
→ N-Glykosylierung im ER, O-Glykosylierung im Golgi-Apparat
Was sind Vor- und Nachteile von tierischen Zelllinien? Benennen Sie zudem zwei Ihnen bekannte Linien.
Vorteile:
• Synthese von komplexen Proteinen
• Korrekte Glykosylierung
• Bildung von Disulfidbrücken
• Qualitätskontrolle (Abbau bei Falschfaltung...)
Nachteile:
• Langsames Wachstum, geringe Zelldichten
• Sehr empfindliche Zellen, anfällig für Scherkräfte
• Kontaminationsanfällig (z.B. mit Viren)
• Sehr teure Medien aufgrund der komplexen Nährstoffansprüche
→ HeLa-Zellen, HEK-Zellen, CHO-Zellen,
Welche Veränderungen wurden am Ti-Plasmid (A. tumefaciens) vorgenommen, um es für die Nutzung in der Biotechnologie zu optimieren?
• Entfernen der tumorinduzierenden und stoffwechselverändernde Gene vom natürlich vorkommenden Ti-Plasmid (t-DNA).
• Möglichkeiten zum Einfügen des Gene of interest (GOI) zwischen die Border-Sequenzen des angepassten Ti-Plasmids (z.B. über geeignete Restriktionsschnittstellen).
• Hinzufügen starker Promotoren, um eine starke Expression des Zielgens in der Pflanze zu gewährleisten (z.B. 35S-Promotor aus CaMV).
• Nutzung als Shuttle-Vektor: Replikationsursprünge („ori“) für E. coli und A. Tumefaciens
• Selektionsmarker (z.B. Antibiotikaresistenzen), um transformierte E. coli, A. Tumefaciens und Pflanzen selektieren zu können.
Was sind die wesentlichen Unterschiede zwischen Pflanzen- und Tierzellen?
Wie kann Fremd-DNA eingebracht werden in Pflanzenzellen und tierische Zellen?
...Pflanzenzellen?
• Agroinfiltration
• Pflanzenviren
• Gene gun
...tierische Zellen?
• Über Infektion mit Viren (Retroviren, DNA-Viren, Adenoviren, Baculoviren, …)
• Über chemische / physikalische Transfektion: • Elektroporation • Lipid-Vesikel (Liposomen)
Beschreiben Sie den Aufbau von (Hemi-)Cellulose!
Hemicellulose ist ein Sammelbegriff für in pflanzlicher Biomasse vorkommende Gemische von Polysacchariden(Vielfachzuckern) in veränderlicher Zusammensetzung. Die am häufigsten vorkommenden Monomere (Monosaccharide= Einfachzucker) sind Pentosen, wie D-Xyloseund L-Arabinose.
Der Name Hemicellulose beruht auf der ursprünglichen, unrichtigen Annahme, dass sie eine Vorstufe (hemi- = griech. für halb-) der Cellulose sei.
Erläutern Sie: Thylakoid
Thylakoide sind in der Biologie Membransysteme in den Chloroplasten pflanzlicher Zellen und in phototrophen Bakterien, in denen die Lichtreaktion der Photosynthese stattfindet.
Erläutern Sie Grana
Thylakoid-Stapel in Chloroplasten
Erläutern Sie Stroma:
Gelartige Substanz, die den Innenraum von Chloroplasten ausfüllt
Erläutern Sie EPO
Erythropoetin, Glykoprotein-Hormon, Wachstumsfaktor, Stimulation der Bildung neuer Erythrocyten
Erläutern Sie Glycogen:
= „tierische Stärke“, Kohlenhydratspeicher bzw. GlucoseSpeicher in Tieren mit zentralem Protein im Zentrum
Erläutern Sie Pektin
Bestandteil der pflanzlichen Zellwand, α-1,4-glykosidisch verknüpfte Galacturonsäure
Erläutern Sie Kernpore
große Proteinkomplexe in der Hülle des Zellkerns, die den Transport von Molekülen zwischen dem Cytoplasma und dem Zellkern ermöglichen
Erläutern Sie Kallus
Komplex undifferenzierter, totipotenter Pflanzenzellen. Durch Gabe von Phytohormonen kann eine Differenzierung der Zellen und u. U. ein lebender Pflanzensprössling entstehen
Beschreiben Sie die verschiedenen Formen des Chromatins!
Euchromatin . hell, leicht zugänglich, aktiv
Heterochromatin: dunkel, schwer zugänglich, dicht gepackt, unzugänglich
Vergleichen Sie die Expressionssysteme „Säugerzellen“, „transgene Pflanzen“ und „Bakterien“ hinsichtlich ihrer Geschwindigkeit, der anfallenden Kosten, der Proteinfaltung und – glykosylierung sowie der gesetzlichen Regulierung!
Nach welchen Kriterien lassen sich Viren klassifizieren? Nennen Sie zu jedem Kriterium mindestens zwei Beispiele!
...der enthaltenen Nukleinsäure ➢ dsDNA ➢ ssDNA ➢ ssRNA ➢ dsRNA
...Morphologie ➢ Fadenförmig ➢ Umhüllt ➢ Kugelförmig ➢ Komplex
...Wirtsorganismus ➢ Tierviren ➢ Pflanzenviren ➢ Baculoviren ➢ Bakterienviren = Bakteriophagen
Stellen Sie eine typische Wachstumskurve für bakterielles Wachstum dar. Zeichnen Sie die unterschiedlichen Wachstumsphasen ein und benennen Sie diese. Auf korrekte Achsenbeschriftung achten!
• Lag-Phase: Gewöhnungsphase/Übergangsphase (keine Zellteilung)
• Log-Phase: Phase des exponentiellen/maximalen Wachstums → gewünscht!
• Stationäre Phase: Keine weitere Vermehrung (häufig Produktbildung), es fehlen essentielle Nährstoffe, evtl. Anhäufung toxischer Nebenprodukte
• Absterbephase: Lyse (= Zersetzung) von Organismen durch hemmende Stoffwechselprodukte, evtl. Selbstvergiftung
Wie lautet die Formel zur Berechnung der Wachstumsrate?
Welche Methoden kennen Sie, um das mikrobielle Wachstum zu bestimmen? Erklären Sie eine Methode genauer.
• Direkt:
• Auszählen in Thoma-Kammer
• Reihenverdünnung • Kolonien zählen
• Indirekt:
• Messung der optischen Dichte in Photometer
• Bestimmung der Biotrockenmasse
• Messen der Stoffwechselaktivität
• Nähere Erläuterung, z.B.
zur OD-Messung: Mit zunehmender Biomasse nimmt Trübung zu. Wenn die Probe mit Licht durchleuchtet wird, nimmt die Streuung des Lichts mit zunehmender Biomasse zu. Die Streuung des Lichts verhält sich bis zu einem Grenzwert linear zur Biomasse. → Biomasse kann aus Messung des Streulichts berechnet werden!
Was sind die wichtigsten Einflussfaktoren auf das mikrobielle Wachstum und warum?
• Temperatur:
Geschwindigkeit biochemischer Reaktionen ist direkt abhängig von der Temperatur → Wachstumsgeschwindigkeit hängt ebenfalls davon ab. Kardinaltemperaturen = maximal möglicher Temperaturbereich (Minimum, Optimum, Maximum)
• pH-Wert:
pH-Wert beeinflusst Proteinstabilität. Undissoziierte organische Säuren können in die Zelle eindringen und dort dissoziieren.
• Wasserverfügbarkeit:
Wasser ist für jedes Leben unentbehrlich, gelöste Moleküle bilden Hydrathüllen und verringern so das verfügbare Wasser.
• Verfügbarkeit von Sauerstoff:
Als terminaler Elektronenakzeptor der Atmungskette essentiell für aerobe Organismen, kann in hohen Konz. aber auch toxisch wirken!
• Verfügbare Nährstoffe:
− Substratkonzentration: Verschiedene Substrate werden als Bausteine und Energielieferanten benötigt. Zu hohe Konzentrationen können aber auch toxisch wirken.
− Spurenelemente und Cofaktoren: Werden für Enzyme benötigt
Welche Reaktionen katalysieren die Enzyme Katalase, Peroxidase, Superoxid-Dismutase?
Warum sind diese Reaktionen für die Zelle von Bedeutung?
Diese Enzyme sind relevant für die Zellentgiftung und den Schutz der Zelle vor reaktiven Sauerstoff-Spezies („ROS“)
Definieren Sie Gärung und Atmung.
→ Atmung:
Abbau organischer Stoffe durch Mikroorganismen zum Zweck der Energiegewinnung unter Übertragung von Elektronen auf extrazelluläre Elektronenakzeptoren Beispiel: In der Atmungskette werden Elektronen von NADH (ursprünglich aus Glucose) auf molekularen Sauerstoff übertragen.
→ Gärung:
Abbau organischer Stoffe durch Mikroorganismen zum Zweck der Energiegewinnung ohne Einbeziehung externer Elektronenakzeptoren; Beispiel: Übertragen der Elektronen von NADH auf Intermediate des Stoffwechsels, es entsteht z.B. Ethanol (Hefen) oder Lactat (Milchsäurebakterien)
Erläutern Sie jeweils schematisch die Ethanol- und Milchsäuregärung und benennen Sie die beteiligten Enzyme und Cofaktoren!
Eräutern Sie Katabolismus und Anabolismus.
Katabolismus = Abbaustoffwechsel; Abbau von Stoffwechselprodukten von komplexen zu einfachen Molekülen zur Energiegewinnung. Die gewonnene Energie wird im Anabolismus zum Aufbau komplexer Moleküle verwendet
Anabolismus = Aufbaustoffwechsel; Nukleinsäuren-, Aminosäure-Synthese usw
Geben Sie die Nettobilanz der Glykolyse an!
Füllen Sie die Tabelle aus.
Zeichnen Sie die vier Basen A, T, G und C der Nukleinsäuren. Wofür stehen die Buchstaben? Welche Basen paaren jeweils miteinander? Wieviele H-Brücken werden jeweils ausgebildet?
• Adenin paart mit Thymin und bildet zwei H-Brücken aus
• Guanin paart mit Cytosin und bildet drei H-Brücken aus.
Beschreiben Sie die DNA-Aufreinigung mittels der Phenol-ChloroformExtraktion. Was muss geändert werden, um RNA aufzureinigen?
1. Zellaufschluss (Enzyme oder Detergenzien, z.B. Lysozym oder SDS)
2. Zugabe der Phenol-Chloroform-Lösung zur Trennung von DNA und Protein
3. Schütteln und zentrifugieren − obere, wässrige Phase enthält Nukleinsäuren − untere, phenolische Phase enthält Proteine und Lipide
4. Abnehmen der wässrigen Phase, vermischen mit kaltem Ethanol und NaCl zur Fällung der DNA
5. Erneute Zentrifugation
6. Waschen des DNA-Pellet mit Ethanol
7. Aufnehmen der DNA in aqua dest.
→ Zur Aufreinigung von RNA müssen chaotrope Salze und eine saure PhenolChloroform-Lösung verwendet werden.
Was sind Restriktionsenzyme und welche Reaktion katalysieren sie? Welche Klasse von Restriktionsenzymen wird üblicherweise in der molekularen Biologie verwendet und warum? Zu welcher Enzymklasse gehören Restriktionsenzyme? Geben Sie ein Beispiel für eine palindromische Sequenz an!
• Enzymklasse: 3 – Hydrolasen
• Eigentlich „Restriktionsendonukleasen“ = „schneiden“ DNA-Moleküle
→ Katalysieren die Spaltung einer Phosphodiesterbindung zwischen Nukleotiden
• Im Labor: i.d.R. Restriktionsenzyme des Typs II
→ Erkennen spezifisch bestimmte palindromische Sequenzen der DNA und spalten die Phosphodiesterbindung an der Erkennungssequenz
Beschreiben Sie den Ablauf einer PCR. Was ist in der Regel das Ziel einer PCR? Welche Komponenten werden für eine erfolgreiche PCR benötigt?
Vier Schritte zur Amplifizierung von DNA-Fragmenten
1. Denaturierung der Template-DNA
2. Anlagerung (= Hybridisierung) der Primer = Annealing (Bestimmte Temperatur: Primerabhängig → 3-4°C unter TM)
3. Elongation (= Verlängerung)
4. Terminierung
Komponenten
- 2Primer im Übschuss
-Template-DNA
- dNTPs
-DNA-Polmerase
- Mg-Ionen
Wie ist ein Nukleotid aufgebaut? Fertigen Sie eine Skizze an! Worin liegt der Unterschied zu einem Nukleosid? Welche Aufgaben können Nukleotide übernehmen?
• Nukleosid: Base + Zucker
• Nukleotid: Base + Zucker + Phosphat
Mögliche Aufgaben:
• Energiespeicher (ATP, GTP)
• Cofaktoren für Enzyme (NAD+ , NADP+ , FAD)
• Signaltransduktion (cAMP, cGMP)
• Bausteine der Nukleinsäuren
