Zentrifugation

Zentrifugation ist ein Verfahren zur Trennung von in einer Lösung als Suspension vorkommenden Biomolekülen in einem künstlichen Zentrifugalkraftfeld.

In Abhängigkeit von Größe, Dichte und Form sedimentieren diese mit unterschiedlicher Geschwindigkeit, sodass eine
Auftrennung erfolgt.

Die Sedimentationsgeschwindigkeit hängt dabei von der eingesetzten relativen Zentrifugalkraft RCF ab, die als Vielfaches der Gravitationskonstante g (980 cm s–1) angegeben wird

Die Sedimentationskonstante ist ein Maß, das verschiedene Partikel nach ihren relativen Sedimentationsgeschwindigkeiten beschreibt.

Die Sedimentationskonstante wird in der Einheit Svedberg [1 S = 10-13 sec.] angegeben.

Die Bestimmung für ein bestimmtes Partikel erfolgt in einem aufwendigen Verfahren, wo die Zentrifugalkraft so lange erhöht wird bis Sie die Reibung zwischen dem Partikel einerseits, und dem Medium und anderen Partikeln andererseits kompensiert. Ab diesem Zeitpunkt hängt die Sedimentationsgeschwindigkeit nur mehr von der Masse des Partikels ab.

• fixed angle rotor
  Eprouvetten sind schräg, für schnelle Reaktionen geeignet
• swing-bucket rotor
  horizontal, Dichtegradienten-Zentrifugation

• Differentielle Zentrifugation
• Dichtegradientenzentrifugation

Partikel, wie etwa Organellen, bilden am Boden der Zentrifugeneprouvette ein Pellet. Wie schnell
sich diese bildet, hängt von der Partikelgröße, der Form und der Dichte ab. Größe und Dichte sind
von Organell zu Organell verschieden und ermöglichen dadurch eine optimale Separation. Mithilfe
von einer ansteigenden Serie der Geschwindigkeit der Zentrifuge (und somit der g-Kraft) kann man
ein konzentriertes Pellet von einem speziellen Organell erhalten. Wenn auch das Pellet noch eine
Vermischung verschiedener Organellen ist, ist diese Art der Zentrifugation ein wichtiger Schritt für
weitere Aufreinigung

Mit dieser Art der Zentrifugation wird ein Mix von verschiedenen Organellen durch einen
Lineargradienten von ansteigender Dichte gebracht. Die typische Durchführung verwendet einen
Zuckergradienten, mit einer hohen Konzentration (z.B. hohe Dichte) am Boden der
Zentrifugeneprouvette g

Die Partikelgröße/-schwere und die Dichte der Organellen beeinflusst die Sedimentation durch den
Gradienten. Sobald der Gradient flach ist, dann ist die Sedimentationsrate der wichtigste Faktor bei
der Teilung von verschiedenen Organellenpopulationen von einander. Wenn man einen Gradient
hat, der die gesamteSpannweite der Dichten abdeckt, dann bleiben die Organellen von
ähnlicher/gleicher Dichte im Gradienten beieinander. Die sehr hohe Dichte am Boden des
Gradienten verhindert die Ausformung von Pellets und dass Material im Gradienten verloren geht.ehend zu einer niedrigeren Konzentration (z.B. niedrige Dichte) am Anfang
der Eprouvette.

Das Meselson-Stahl-Experiment war der experimentelle Beweis für die semikonservative
Replikation der DNA-Doppelhelix. Zunächst wurde E. coli in 15N-haltigen Medium gezüchtet, damit es zum Einbau des Stickstoffisotops in die DNA kam. Anschließend wurde das Medium gegen ein Medium, frei von 15N ausgetauscht, und weitergezüchtet. Aus den Zellen des neuen Mediums, wurde DNA nach einer-, sowie nach zwei Zellteilungen entnommen und mittels Dichtegradientenzentrifugation untersucht. Nach einer Zellteilung ließ sich nur sogenannte mittelschwere DNA nachweisen, wohingegen nach einer weiteren Teilung mittelschwere- und normale DNA vorhanden waren. Meselson und Stahl schlossen daraus, dass die von der ursprünglich schweren DNA, in der beide DNA-Moleküle der Doppelhelix mit 15N markiert waren, abstammenden Tochtermoleküle jeweils einen neu synthetisierten- und einen ursprünglichen Strang enthalten müssen.