Zellkulturtechnik, Kontrollfragen und Prüfungsfragen

Einsatz pflanzlicher und animaler Zellen/Gewebe für in vitro Herstellung von:

·         Wirkstoffen für Therapeutika und Diagnostika

·         Zellen Geweben und Organen

Einsatz animaler Zellen/Gewebe für Zytotoxizitätests:

·         Reduktion und Ersatz von Tierversuchen

Applikationen im Pharma und Kosmetikbereich wie:

·         Sekundärstoffe

·         Rekombinante Proteine

·         Vakzine

·         Biotechnologische Taxol Produktion

·         Veterinärimpfstoffe

·         Antikörper

·         GMP-Produktion möglich weil in einem geschlossenen, kontrollierbaren System

·         Keine Kontaminationen durch Boden oder Schädlinge

·         Feld = offenes System = Faktoren, die wir nicht beeinflussen können wie Klima, Krankheit, Erde etc.

·         So wird Produktion reproduzierbar und validierbar!

·         Keine Abhängigkeit von abiotischen Störfaktoren wie Klima, Wetter, Jahreszeiten

Folien 16 – 22

Grösse/ Morphologie:

Ø  Pflanzenzellen besitzen Grösse von 10 - 100µm und sind deshalb verhältnismässig gross ( andere Serologische  Pipetten mit grösserer Öffnung)

Ø  Kugelförmige oder stäbchenförmige Morphologie

Ø  In Vitro Kultivierungsprozesse unterscheidet sich gegenüber den Kultivierungsprozessen für Bakterien wegen ihrer Grösse und Metabolismus

Ø  Pflanzenzellen kleinere Oberfläche als Bakterienzelle

Folge: bessere Durchmischung der Zellen für bessere Verteilung von Nährstoffen

Ø  Wegen ihrer Grösse empfindlicher auf Scherkräfte (geeigneten Bioreaktor auswählen)

Wachstum/ Verdopplungszeit:

Ø  Temperatur für Inkubation zwischen 23 und 29°C

Ø  Verdopplungszeit von Tagen

Ø  CO₂-Gehalt 0.1 und 5%

Ø  pH- Wert zwischen 5-6, keine Regulation mit Säure oder Lauge!

Ø  Wachstumsrate kann durch verschiedene Phytohormone verbessert werden

Produktbildung:

 höhere Produktabgabe ins Medium kann mit Elicitoren benutzt werden

·         Kalluskultur

·         Suspensionskultur

·         Hairy Roots

·         Embryokultur

·         Protoplastenkultur

Etablierung:

Etablierung von Suspensionskultur erfolgt durch Passage von Kalluls in ein Erlenmeyer mit Suspensionsmedium

Siehe Bild

Einfache Medien, welche aus wässrigen Lösungen bestehen und enthalten verschiedene wasserlösliche Zusätze.

Basalmedium Bestandteile:

·         C-Quelle (Saccharose, Glucose, Fructose, Sorbitol) Anteil ca. 2-5%

·         Organische Supplemente ( Aminosäuren, Vitamine und Co-Faktoren)

·         Anorganische Supplemente:

-          Mikroelemente in µM Konzentrationen (Fe, Mn, Cu….)

-          Makroelemente in mM Konzentrationen (N, S, P….)

MS ( Murashige and Skoog)- Basalmedium und Adaptionen davon (in ca. 80% der Anwendungen)

 Basalmedium mit Zusätzen wie Phytohormonen

NT1-Medium

Sterilisation mittels feuchter Hitze (121°C bei 15-20min) oder Sterilfiltration (0.2µm)

Wasser zugeben, Medium zugeben und steril filtrieren oder autoklavieren

Vitaminzugabe nach Autoklavieren

Es wird jedoch selten Steril filtriert da sich Pflanzenzellen gut sterilisieren lassen!

Was sind Phytohormone?

biochemisch wirkende pflanzeneigene (endogene) organische Verbindungen, die als primäre Botenstoffe (sog. Signalmoleküle) Wachstum und Entwicklung der Pflanzen steuern und koordinieren.

Da sie nicht alle Kriterien der eigentlichen Hormone erfüllen, können sie auch als Wachstumsregulatoren bezeichnet werden.[1]

Die Pflanzenhormone werden in der Pflanze vom Entstehungs- zu einem spezifischen Wirkungsort transportiert, entweder von Zelle zu Zelle (z. B. Auxine), über die Leitungsbahnen (z. B. Cytokinine), oder über den Gasraum zwischen den Zellen (Ethylen).

Welche gibt es und Einsatz:

·         2.4D -> Kallusinduktion und Differenzierung ( führt aber zu genetischer Veränderung )

·         IAA-> Zellstreckungshormon welches die Differenzierungsvorgänge steuert

·         Auxin (je nach Konzentration, Stimulation von Zellwachstum und Unterstützung der Zellteilung)

·         Cytokinin ( je nach Konzentration, Stimulation von Zellwachstum und Unterstützung der Zellteilung)

Oberflächensterilisation findet  bei der Vorbereitung des Pflanzenmaterials, vor der Platzierung des verletzten Pflanzenexplantates bei der Kallusinduktion statt.

3-Stufen-Sterilisation:

1.       Vorsterilisation:

Reinigung mit Leitungswasser oder Abreiben mit Ethanol

2.       Sterilistaion:

Einlegen in 0.5-10% Hypochloritlösung mit Zusätzen für 5-30min

(optimale Konzentration und Sterilzeit müssen durch Experimente bestimmt werden!!!)

3.       Nachsterilisation:

3-maliges Waschen mit sterilem! Wasser

Bei verholztem Material erfolgt eine zusätzliche Ultraschallbehandlung!!!!

Direkte Methoden:

Ø  über Frischgewicht

Ø  über  Trockengewicht

Ø  über die Zellmasse mittels PCV(%) = Packet Cell Volume

Ø  Zellzählung

Indirekte Methoden:

Ø  Über Konduktivität

Ø  Über pH-Wert

->  Diskussion der Methoden auf Folien 50-56

Fakten für typische Wachstumskurve:

Lag-Phase:

Ø  Sollte kleiner als 120h für Pflanzenzellen sein

Ø  Zellen vermehren sich kaum

Log-Phase:

Ø  Zellzahl steigt exponentiell

Stationäre-Phase:

Ø  Zellzahl stagniert

Absterbephase

Siehe Bild

Bioreaktortypen:
    Bioreaktoren mit mechanischem Energieeintrag

Rührreaktor oder Trommelreaktor
Zellen werden mit genügend Sauerstoff und Nährstoffen versorgt
Nachteil: hohe Scherkraft
Lösung: Einsatz von Axialrührer um Scherkräfte klein zu halten!

    mit pneumatischen Energieeintrag

Airliftreaktor oder Blasenreaktor
Durch Wirbelentstehung werden Sauerstoff und Nährstoffe an die Zellen gebracht

    mit hydraulischen Energieeintrag
Bettreaktoren
Membranreaktoren

Bioreaktoren:

•    RITA (Organkulturen)

    Sterile Kultivierung von Organkulturen
    Durch Überdruck lässt sich der Flüssigkeitspegel im Behälter einstellen
    Ein geregeltes System wie die Pflanze in Flüssigkeit getaucht werden kann oder nicht und einfache Anwendung

•    Wave Reaktor 

    Reduzierte Schaumbildung ( weil Begasung über die Oberfläche und nicht über das Medium)
    Gleichmässige Energiedissipation

•    Rührreaktor

    Sorgt für eine gute Durchmischung im ganzen Reaktor
    Stromstörer können weggelassen werden führt zu Kontaminationsquellen sowie schwieriger zu reinigen
    Rührgeschwindigkeit kann eingestellt werden
    Für grosse Produktion von bis zu 75m3 geeignet

•    Airlift Reaktor

    Inneres Leitrohr hat Durchmesser von 0.7m, von dem bis Aussen 0.3m d.h. aussen und innen gleiches Volumen an Flüssigkeit sorgt für gute Durchmischung der Suspension
    Zusätzliche schonende Durchmischung durch Lufteintrag

Ø  Rührreaktor

Ø  Airliftreaktor

Ø  Blasensäule

Ø  Trommelreaktor

Ø  Einwegreaktoren

Ø  Rührreaktoren werden bei gut / schnell- wachsenden Kulturen eingesetzt

Ø  Volumenkapazität bis zu 75m³ also für mittel- grossvolumige Anwendungen

Ø  Dominanz der Rührreaktoren aus Glas oder Edelstahl (einfach zu reinigen und wiederverwendbar)

Ø  Das Einfachste Prinzip (einfaches Rühren, Pumpen etc.)

Weitere Gründe?

Blasensäulen und Airliftreaktoren sind wegen der hohen Schaumbildung nicht geeignet. Die Schaumbildung entsteht wegen den Polysacchariden in den Kulturmedien. Zellen flotieren an die Oberfläche, trocknen aus oder kleben an der Reaktorwand.

Um das zu verhindern können Antischaummittel eingesetzt werden ( z.B. auf Silikonbasis)

Ø  Veränderung der Morphologie

Ø  Meist Kugelförmig und binden an andere Zellen ( Zellverbände)

Ø  Schlechte Vermehrung

Ø  Zunahme von Biomasse

Ø  Verminderte Produktausbeute

Ø  Erwärmung des Mediums

Lösung: Einsatz von Axialrührern! Sind grossflächig und drehen langsam

Ø  Erhöhung von Verdopplungszeiten und Stabilität

Ø  Gene für die Produktion von Nährstoffen (  Vitamine etc.) können eingeschleust werden

Nennen sie vier häufig eingesetzte Methoden:

Indirekter Gentransfer:

Ø  Dabei handelt es sich um eine Infektion des verletzten Pflanzengewebes mit A. tumefaciens und A. rhizogenes. Die Bakterien enthalten modifizierte Plasmide.

Direkter Gentransfer:

Ø  Partikelbeschuss ( Gold- und Wolframkügelchen)

Ø  PEG

Kältelagerung:

Ø  Vitalität höher und weniger Zellen sterben ab

Ø  Lagerung der Suspensionzellen bei 2-10°C bei reduzierten Licht und Sauerstoffeinflüssen

Ø  Zellen werden gezwungen ihr Wachstum zu stoppen und bleiben in der G0 Phase

Ø  Dem Kulturmedium wird hierfür Stabilisator vermischt ( 1% Gelatine)

Ø  Lagerung bis zu 4 Monate

Cryopreservation:

Mit Flüssigstickstoff

Stoppt alle zellulären Prozesse

Es sterben viele Zellen ab

Zellsuspensionen in Kryoröhrchen werden langsam eingefrohren und nur bei hoher Vitalität und Zelldichte

Medium enthält DMSO zur Verminderung der Kristallbildung und Schädigung der Zellen

Siehe Bild

Ø  Es ist darauf zu  achten, dass von Anfang an genügend Zellen vorhanden sind

Ø  Lichteinflüsse können Kulturen positiv beeinflussen z.B. 16h Tageslicht, 8h Nacht (durch interne UV-Lampen und Glasfaserkabel erreicht man das)

Ø  Art des Reaktors

Ø  Benutze Basalmedien

Ø  Auswahl der Auxine

Ø  Zusammensetzung der Gasphase

Ø  Kontaminationen

Ø  Generelle Wachstumsbedingungen wie CO2, pH etc..

Ø  Zugabe von Auxinen -> Anregung der Zellteilung

Folge: erhöht die Biomasse und die sekretierte Menge am Produkt

Ø  Optimale Kultivierungsparameter einhalten

Ø  Zweiphasenprozesse

Nach der ersten Phase des Zellwachstums werden Elicitoren zugegeben (Jasmonsäure), Zelle wird gezwungen, die Produkte zu  selektieren

Ø  Immobilisierung der Zellen

Zellen sind nicht  direkt Scherkräften ausgesetzt

Wann:

Pflanze wächst  auf Oberfläche von festen/flüssigen Substraten

Wenn Pflanzen nur auf festen Grenzflächen zur Gasphase wachsen können oder wenn streng aerobe Bedingungen herrschen müssen

Wie:

Petrischalen

Rita 

Plant made pharmaceuticals

Pflanzen, die genutzt werden, um rekombinante Proteine herzustellen. ( vor allem aus der Frucht der Pflanze)

Beispiele:

Reis:

Lysozyme

Lactoferrin

Tabak:

Vaccine

Zwei Stofftransfere:

Ø  Aufnahme von Stoffen (Stofftransfer vom Medium z.B. Nährstoffe)

Ø  Abgabe von produzierten Stoffen ins Medium

Aufnahme von Stoffen:

Bioreaktoren müssen ausreichende Nährstoffzufuhr der Zellen garantieren.

Wie?

->  Radius und Geschwindigkeit des Rotors

Biowavereaktor? -> durch die Rotations- und Schüttelgeschwindigkeit

Siehe Bild

Shikonin (Farbstoff für Kosmetik)                    weisse Biotechnologie

Rosmarinsäure (Kosmetik/Pharmazie)          weisse Biotechnologie

Taxolproduktion                                                 rote Biotechnologie

Penicillin                                                              weisse Biotechnologie

Siehe Bild

Siehe bild

Siehe Bild

Wann wird er angestrebt und warum:

Wird nach Transformation von Protoplasten (embryonale Zellen) angestrebt. Aus bröckligem Kallus kann danach einfacher eine Suspensionskultur hergestellt werden.

2 Methoden um Typ 2 Kallus zu etablieren:

Zusätze von folgenden Substanzen ins Medium:

• Dicamba
• Aminosäure-Stickstoff

Kallus wird mit Agrobacterium Tumefaciens zusammenkultiviert

Technische Umsetzung:

• Externe UV-LampenInterne
• Einrichtungen über Glasfaserkabel

Licht und tierische Zellen:

Untergeordnete Rolle

Licht und pflanzliche Zellen:

Gewisse Metabolismen können angeregt werden.

Folge: Verbesserung der Wachstumsrate und Produktbildung