Zellkultur

Grundlagen zum Arbeiten mit Zellkulturen

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M. C.

Étudier

M. C.

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Diese Lernkarten behandeln grundlegende und fortgeschrittene Techniken der Zellkultur auf Universitätsniveau. Sie decken Themen wie Zellzüchtung, Methoden zur Analyse von Zelleigenschaften, Subkultivierung und spezifische Techniken wie Transfektion, Elektroporation und die Verwendung von Hybridomzellen ab. Die Karteikarten sind besonders nützlich für Studierende und Forscher, die sich mit zellbiologischen Experimenten, toxikologischen Tests und der Herstellung rekombinanter Proteine befassen.

Cartes-fiches

Utilisateurs

Langue

Allemand

Catégorie

Biologie

Niveau

Université

Créé / Mis à jour

15.04.2013 / 20.07.2017

Fichiers de cartes similaires

Wie werden Hepatozyten isoliert?

durch Perfusin mit geeigneter Lösung (z.B.: EDTA, Collagenasen, Trypsin,...)
wichtig: ausplattieren auf Collagen beschichtete Kulturgefäße

Was sind PC-12 Zellen?

Phäochromocytomzellen: isoliert aus Tumorzellen im Nebennierenmark von Ratten
durch reversible Stimmulierung mit Nerve Growth Faktor bilden sich in Gewebekulturen neuronale Fortsätze (inclusive Bildung Neurotransmittern Noradrenalin & Dopamin) --> Analyse neurobiologischer Prozesse

Was sind Endothelzellen und aus welchen Organismen werden sie für Zellkulturen gewonnen?

auskleidende Plattenepithelzellen desGefäßsystems

gewonnen aus Rindern (Lungenarterie) Mensch (Nabelschnurblut)

Was sind Probleme und Besonderheiten von Zellkulturen mit Invertebratenzellen?

Problem: wenig Ausgangsmaterial

Kulturtemperatur deutlich niedriger als bei Vertebratenzellen (nur 25-30°C)
PO₄ -gepuffert daher keine CO₂ -Begasung notwendig

Was sind Sf9-Zellen und warum sind sie so wichtig?

Ovarienzellen aus Spodoptera frugiperda (Mottenart)
zur Gewinnung rekombinanter Proteine -sehr hohe Ausbeute

Was ist das Ziel der in-vitro-Toxizität?

möglicher Ersatz für Tierversuche
Vorauswahl/-Analyse von Wirkstoffen

Was sind wichtige Parameter für in-vitro-toxizitätstests?

-möglichst lineare Beziehung Wirkung und Zellzahl zur vernünftigen Beurteilung zu erwartender in vivo Wirkung
-pharmakogenetisch relevanter Wirkungsbereich
-reproduzierbare Dosis-Wirkungsbeziehung

Wie funktioniert der CAM-Test?

Ersatzmethode für Draize-Test (Test zur Untersuchung von Schleimhautreizung an Kaninchenauggen)

-Öffenen angebrüteter Hühnereier
-Aufbringen der Testsubstanz auf Chorionallantoismembran
--> Membran wird unterschiedlich stark beschädigt (nicht reizend bis stark reizend)

Was gilt es hinsichtlich der Konzentration, des Applikationszeitpunktes & Endpunkt bei in-vitro Toxizität zu beachten?

vor Beginn des Test ist zu planen

-wie lange soll Substanz einwirken
-welche Hilfsstoffe werden verwendet
-wann beginnt die Inkubation mit der Substanz (Anheftungszeit beachten!)
-Versuchsendpunkt muss klar definiert und strikt eingehalten werden

Was ist der MTS Test?

Methode zur Bestimmung der Proliferationsrate
Bestimmung der Aktivität der mittochondrialen Dehydrogenase
Vorteil gegenüber anderen Methoden unabhänig von Replikation der DNA

Was ist das Ziel der Proliferationsanalyse und welche Methoden gibt es?

Kurzfristige Beobachtung der Stoffwechselaktivität der Zellen

Methoden: Cell Titer Glow, MTS, 3H-Thymidineinbau

Was ist Transfektion und welche Methoden gibt es?

Einbringung neuer, fremder DNA in die Zelle

Methoden: CaPO₄-Präzipitation, Elektroporation, Lipofektion, Nucleofection, Virusinfektion

Wie funktioniert CaPO₄-Präzipitation?

-DNA wird mit CaCl₂ & Na₂HPO₄ gemischt --> Bildung von CaPO₄ Kristallen mit DNA Einschlüssen
Integration in Zellen durch Phagozytose

Kotransfer von verschiedenen DNA Fragmenten in dieselbe Zelle möglich

Wie funktioniert Elektroporation?

Eine Mischung aus DNA und Zellen wird unter pulsierende Spannung gesetzt
--> Repolarisationseffekt an der Zellmembran --> Aufnahme DNA in die Zellen

Was ist das Ziel von Klonierung? welche Methoden gibt es?

Isolierung genetisch identer Zellen mit anschließender Vermehrung und Analyse

Methoden:
-Limitid -Dilution-Klonierung
-Klonierung in Softager

Wofür können Viren genützt werden?

-Analyse viraler Eigenschaften
-Mittel zum Gentransfer
-Infektion von Zellkulturen

Welche Methoden zur Zellsynchronisation gibt es?

-Abkühlen
-Schütteln
-Serumentzug
-spezifisch wirkende Substanzen

Was ist eine Populationsanalyse und wie wir sie durchgeführt?

Analyse der Wachstumseigenschaften von Zellen durch wiederholte Zellzahlbestimmung

Was ist der Zeck von Cytometrie?

-Analyse des Zellzyklus
-Bestimmung von zellulären Subpopulationen

Wie führt man eine Chromosomenpräperation durch?

-Arretierung von Zellen in der Metaphase mit Colcemid
-Schwellen der Zellen in Hypertonem Medium
-Fixierung & Anfärbung der Chromosomen

Welche Anwendungsmöglichkeiten für Gewebe- & Zellkulturen gibt es?

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- Erforschung (Metabolismus)
-Modifikation (Transfektion = Einbringen von Fremd DNA, Fusion= Verschmelzung von Zellen)
- Austestung von Substanzen (in-vitro Tests)
-therapeutische Anwendung (Stammzellen, IVF= Invitrovertilisation)
-Produktion von (rekombinanten) Proteinen

Welche 3 Einflussfaktoren spielen beim Arbeiten mit Zellkultur eine Rolle?

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Direkte Zellkulturmaterial Umgebenung (Medium, Gefäße)
Arbeitsbereich (sterile Werkbank)
Umfeld (Labor, Umwelt)

Welche Gefahren gibt es in Zellkulturen?

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-Viren
-Bakterien, Hefe, Pilze
-DNA (rekombinante Plasmide, virale DNA)
- andere Zellen (Kreuzkontaminantion)

Welche Sicherheitsforschriften sind zu beachten?

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-ArbeitnehmerInnen Schutzgesetz
-Gentechnikschutzgesetz
-Verordnung biologische Arbeitsstoffe
-Grenzwertverordnung
-Arzneimittelgesetz
-Betriebsanlagebewilligung
-firmeninterne Vorschriften

Wie teilt man biologische Agenzien nach ihrem Gefährdungspotenzial ein?

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-Gruppe 1 (ohne GP): harmlos
-Gruppe 2 (geringes GP): können behandelbare Krankheiten verursachen
- Gruppe 3 (mäßiges GP): können schwere aber behandelbare Krankheiten verursachen
- Gruppe 4 (hohes GP): können schwere nicht behandelbare Krankheiten verursachen

Übliche Sicherheitsmaßnahmen im Labor:

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- Türen Fenster geschlossen halten
- kein Essen, Trinken, Rauchen, ec.
- Labormantel & andere Schutzkleidung
- kein Mundpipettieren (Pipettierhilfe)
-keine Aerosole
- Hände waschen
- saubere, aufgeräumte Laborräume
- Schulung der Mitarbeiter
-Ungezieferbekämpfung

Was ist bei der Entsorgung biologischen Materials zu beachten?

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- Inaktivierung des Materials (Autoklav, chemisch) vor Verlassen des Laborbereiches
- Verbrennung Inaktiviertes Material
-Schutz vor Verletzungen (Glasbruch, Kanülen)

In welche Bereiche ist der Arbeitsbereich unterteilt?

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-Reinigungsbereich (kann schmutzig sein)
-Vorbereitungs- & Verarbeitungsbereich (sollte sauber sein)
-Sterilbereich (muss möglichst rein sein)

Welche Einrichtungsgegenstände sollte Reinigungsbereich enthalten?

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-Spültisch
- Labor-Spülmaschine
-Trockenschränke
-Autoklav
-Wasseraufbereitungsanlage

welche Einrichtungsgegenstände sollte der Vorbereitungs- & Verarbeitungsbereich beinhalten?

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-Arbeitstisch (Gas-, Wasser-, Elektroanschlüsse)
-Labor-Geräte (pH-Meter, Rührer, Osmometer, ect.)
-Aufbewahrungs- & Stauraum
-Kühl- & Gefrierschränke (+4°C, -20°C, -180°C, -196°C)

Welche Einrichtungsgegenstände sollte der Sterilbereich haben?

-sterile Werkbank
-Brutschrank
-Wasserbad
-Kühlzentrifuge
-Kühl/Gefrierkombination
-Tiefkühltruhe (-80°C optimal)

Welche Anforderungen werden an eine sterile Werkbank gestellt?

-bietet Zellkulturgut Schutz vor Verunreinigung durch Staub oder Microorganismen
- soll handhabende Person vor möglichen Gefahren die vom Zellkulturmaterial ausgehen schützen
- leicht zu reinigen und desinfizieren

Besondere Sicherheitsmaßnahmen beim Arbeiten mit Zellkulturen?

-Sciherheitswerkbänke
-Beschränkung & Kontrolle des Zugangs
-Desinfektion von erregerhaltigem Meterial vor Verlassen des Arbeitsraumes
-Überdruck im Arbeitraum durch künstliche Belüftung
- Hinweisschilder
- Impfung (Hepatistis)
- HIV negatives Material

Welche Typen von sterilen Werkbänken gibt es?

-Typ 1: mit horizontaler Lufteinströmung
- Typ 2: Klasse 1 ( Schutz der Personen)
-Typ 3: Klasse 2 (Schutz der Person & des Arbeitsgegenstandes)
Typ 4: Klasse 3 (erhöhter Schutz für Person)

Was ist die Funktion eines Brutschrankes und dessen notwendige Eigenschaften?

Funktion: Inkubation des Zellmaterials

Eigenschaften: Temperaturkonstanz, interne Raumbefeuchtung, Zufuhr von Gasen & prüfen des CO₂ Gehaltes (5%), desinfizierbar

Welche Eigenschaften müssen Kulturgefäße aufweisen?

-steril
-adäquate Haftungseigenschaften für Zellen
-optisch transperent
-ev. wiederverwendbar

Wofür werden Zellkulturflaschen genutzt?

Vermehrung von Zellkulturen

meist aus Polysterol
verschiedene Größen (z.B.: T25 = 25cm² Wachstumsfläche)

Wofür benutzt man Petrischalen, Vielfachschalen oder Mikrotiterplatten?

Transfektion von Zellen, Klonierung, Bioassays (=biologische Untersuchung)

Wofür benutzt man Objektträger?

Züchten von Zellen und anschließendes Anfärben

Wie können die Anhaftungseigenschaften von Kunststoffen verbessert werden?

hydrophilisierung der Oberfläche durch Einbau geladener Gruppen
Methoden:
-Gamma- Bestrahlung
-chemische Behandlung
- Lichtbogenbehandlung
- Plasmaverfahren

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Was sind Endothelzellen und aus welchen Organismen werden sie für Zellkulturen gewonnen?

auskleidende Plattenepithelzellen desGefäßsystems

gewonnen aus Rindern (Lungenarterie) Mensch (Nabelschnurblut)

Was sind Probleme und Besonderheiten von Zellkulturen mit Invertebratenzellen?

Problem: wenig Ausgangsmaterial

Kulturtemperatur deutlich niedriger als bei Vertebratenzellen (nur 25-30°C)
PO₄ -gepuffert daher keine CO₂ -Begasung notwendig

Was sind Sf9-Zellen und warum sind sie so wichtig?

Ovarienzellen aus Spodoptera frugiperda (Mottenart)
zur Gewinnung rekombinanter Proteine -sehr hohe Ausbeute

Was ist das Ziel der in-vitro-Toxizität?

möglicher Ersatz für Tierversuche
Vorauswahl/-Analyse von Wirkstoffen

Was sind wichtige Parameter für in-vitro-toxizitätstests?

-möglichst lineare Beziehung Wirkung und Zellzahl zur vernünftigen Beurteilung zu erwartender in vivo Wirkung
-pharmakogenetisch relevanter Wirkungsbereich
-reproduzierbare Dosis-Wirkungsbeziehung

Wie funktioniert der CAM-Test?

Ersatzmethode für Draize-Test (Test zur Untersuchung von Schleimhautreizung an Kaninchenauggen)

-Öffenen angebrüteter Hühnereier
-Aufbringen der Testsubstanz auf Chorionallantoismembran
--> Membran wird unterschiedlich stark beschädigt (nicht reizend bis stark reizend)

Was gilt es hinsichtlich der Konzentration, des Applikationszeitpunktes & Endpunkt bei in-vitro Toxizität zu beachten?

vor Beginn des Test ist zu planen

Was ist der MTS Test?

Methode zur Bestimmung der Proliferationsrate
Bestimmung der Aktivität der mittochondrialen Dehydrogenase
Vorteil gegenüber anderen Methoden unabhänig von Replikation der DNA

Was ist das Ziel der Proliferationsanalyse und welche Methoden gibt es?

Kurzfristige Beobachtung der Stoffwechselaktivität der Zellen

Methoden: Cell Titer Glow, MTS, 3H-Thymidineinbau

Was ist Transfektion und welche Methoden gibt es?

Einbringung neuer, fremder DNA in die Zelle

Methoden: CaPO₄-Präzipitation, Elektroporation, Lipofektion, Nucleofection, Virusinfektion

Wie funktioniert CaPO₄-Präzipitation?

-DNA wird mit CaCl₂ & Na₂HPO₄ gemischt --> Bildung von CaPO₄ Kristallen mit DNA Einschlüssen
Integration in Zellen durch Phagozytose

Kotransfer von verschiedenen DNA Fragmenten in dieselbe Zelle möglich

Wie funktioniert Elektroporation?

Eine Mischung aus DNA und Zellen wird unter pulsierende Spannung gesetzt
--> Repolarisationseffekt an der Zellmembran --> Aufnahme DNA in die Zellen

Was ist das Ziel von Klonierung? welche Methoden gibt es?

Isolierung genetisch identer Zellen mit anschließender Vermehrung und Analyse

Methoden:
-Limitid -Dilution-Klonierung
-Klonierung in Softager

Wofür können Viren genützt werden?

-Analyse viraler Eigenschaften
-Mittel zum Gentransfer
-Infektion von Zellkulturen

Welche Methoden zur Zellsynchronisation gibt es?

-Abkühlen
-Schütteln
-Serumentzug
-spezifisch wirkende Substanzen

Was ist eine Populationsanalyse und wie wir sie durchgeführt?

Analyse der Wachstumseigenschaften von Zellen durch wiederholte Zellzahlbestimmung

Was ist der Zeck von Cytometrie?

-Analyse des Zellzyklus
-Bestimmung von zellulären Subpopulationen

Wie führt man eine Chromosomenpräperation durch?

-Arretierung von Zellen in der Metaphase mit Colcemid
-Schwellen der Zellen in Hypertonem Medium
-Fixierung & Anfärbung der Chromosomen

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