Zellkultur
Grundlagen zum Arbeiten mit Zellkulturen
Grundlagen zum Arbeiten mit Zellkulturen
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Cartes-fiches
Welche Verfahren gibt es um Reinstwasser herzustellen
-Destillation (2-4 Schritte, energieaufwendig,
für pharmazeutische Produktion)
-Ionentauschverfahren
-Membrantrennverfahren (reverse Osmose)
Nach welchem Verfahren arbeiten übliche Reinstwassersysteme?
-Wasser extern im Ionentauschverfahren vorgereinigt
-Makroporöser Austauscher zur Bindung von Kolloiden
-UV-Bestrahlung zur Entkeimung
-Ultrafiltrationsstufe
Was sind die Parametre der Reinstwasser-Qualität?
-spezifischer Widerstand bzw. Leitfähigkeit
-organische Verunreinigungen
-Pyrogengehalt
Nenne einige Beispiele für Puffersubstanzen:
-Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) mit CO2
-HEPES
-Phosphate (NaH2PO4, Na2HPO4)
-Aminosäuren (Arginin, Hisdidin, Cystein)
-"Phenolrot"
Was ist Osmolalität?
ergibt sich aus der Menge gelöster osmotisch wirksamen Komponenten
hauptsächlcih wirksame Komponenten: Salze, AS, Proteine, Zucker
Was sind Seren? Was sind mögliche Komponenten von Seren?
Mischungen aus mehr als 1000 mehr oder weniger bekannten bzw. definierten Komponenten
mögliche Komponenten:
-Hormone
-Bindungsproteine & Anheftungsfaktoren
-AS
-Salze
-Spurenelemente
-Puffersubstanzen
-Toxine, Microorganismen
Nenne einige häufig verwendete Seren:
-Fetales Kalbsserum (FKS) aus Rinderfeten
natürliche Gerinnung, hoher Fructoseanteil
-Neugeborenen Kälberserum (NKS) von 1-10 TAge alten Kälbern
höherer Immunglobulingehalt
-Kälberserum (KS) hoher Immunglobulingehalt
-Pferdeserum (PS) weniger Endotoxine
-Humanserum (HS) sehr beschränkter Einsatz
Welche Vor- & Nachteile hat die Hitzeinaktivierung von Seren?
vor Verwendung Hietzeinaktivierung bei 30-56°C
Vorteile:
-Zerstörung des Komplements
-Fibrinfällung
-Mycoplasmen & Viren (teilweise) Inaktivierung
Nachteile:
-Enzyminaktivierung
-Vitamininaktivierung
-Zerstörung diverser thermolabiler Komponenten (Immunglobuline, Anhäftungsfaktoren, Wachstumsfaktoren)
-beschleunigte Oxidations- & Katalyseprozesse
Wie können Viren entfernt werden?
-Hietzeinaktivierung erfordert aber oft höhere Temperatur bzw längere Zeitdauer --> mehr unerwünschte Effekte
-Gamma Bestrahlung
-UV-Bestrahlung
-pH-Absenkung (zeitlich begrenzte pH-Absenkung)
Was sollte man vor der Verwendung eines Serums prüfen?
-Ursprung
-Virusfreiheit
-BSE Freiheit
-proliferative Wirkung
Wozu dient die reglemäßige mikroskopische Kontrolle der Zellkultur?
-Überprüfung der Vitalität & Morphologie
-Überprüfung auf (Kreuz)Kontamination
-grobe Abschätzung der Zellzahl
-Bestimmung des Grades der Konfluenz
daraus kann unter Umständne abgeleitet werden ob ein häufigerer Medienwechsel sinnvol ist oder eine Passagierung durchzufüheren ist
Was ist bei einem Medienwechsel von adhärenten Zellen zu beachten?
Absaugen des verbrauchten Mediums (hälfte bis alles) und ducrh frisches ersetzen
Achtung: Zellrasen nicht berühren oder bei Medienzugabe ablösen
Was ist bei einem Mediumwechsel von
Suspensions-Zellen zu beachten?
Zellen sedimentieren lassen bzw. abzentrifugieren
absuagen des verbrauchten Mediums (Hälfte bzw. soweit es geht) und durch frisches ersetzen
Alternative: nur Medium zusetzen (Volumserhöhung)
bzw. Teil der Zellsuspension entfernen (Ernte) und durch frisches Medium ersetzen
Was ist unter dem Begriff der Subkultivierung zu verstehen und warum wird sie durchgeführt?
Subkultivierung= Passagierung: Überführen einer bestehenden Zellkultur in mehrere bzw. größere Gefäße
zuviele Zellen in einem Gefäß bewirkt
-zu starken Medienverbrauch
-Absinken der Proliferationsrate
-Stillstand der Kultur durch Konfluenz
Was macht man um Zellen von der Oberfläche abzulösen?
-Anhäftungsproteine (z.B.: Integrine) durch Proteasen (z.B.: Trypsin)entfernen
-Ionische Wechselwirkung durch Komplexbildner (z.B.: EDTA) inhibieren
Welche Methoden zur Subkultivierung adhärenter Zellen gibt es?
Durch Abklopfen
enzymatisch
ducrh Abschabung
Welche Arbeitsschritte gibt es beim Subkultivieren adhärenter Zellen durch Abklopfmethode?
-Kulturflaschen ev. 30min bei +4°C vorinkubieren
-Zellen vom Flacshenboden lösen durch seitliches Klopfen mit Hand bzw. Abspülen mit Medium
-Entfernen von Medium durch Abzentrifugieren
-Zellen in frischem Medium aufnehmen und auf neue Flaschen verteilen
Welche Arbeitsschritte sind bei der Subkultivierung adhärenter Zellen mittels Enzymen durchzuführen?
-Medium absuagen & Zellen mit PBS (Pufferlösung) spülen
-Enzymlösung zusetzten & einwirken lassen (1-15min)
-Ablösen der Zellen beobachten (ev. mit klopfen nachhelfen)
-abgelöste Zellen suspendieren und zu Medium pipettieren
Welche Arbeitsschritte sind bei der Subkultivierung adhärenter Zellen durch abschaben durchzuführen?
-Medium absaugen und Zellen mit PBS waschen (CA/Mg-frei)
-frisches Medium zusetzten und Zellen mit Zellschaber abschaben
-abgelöste Zellen mit Pipette suspendieren
-Zellen auf neue Flaschen verteilen (ev. vorher Medium wechseln)
Wie geht man bei Subkultivierung von Suspensionszellen vor?
-gewünschte Zellmenge mit Medium von Stammkultur abnehmen
-ev. Medium durch abzentrifugieren entfrenen
-Zellen in frisches Medium aufnehmen bzw. zusetzten und auf neue Flaschen verteilen
Wofür ist die exakte Zellzahlbestimmung notwendig?
-Ermittlung der Verdoppelungszeit
-Herstellung eines definierten Inokulums für Produktionszwecke
-Schaffung definierter Bedingungen
Mit welchen Hilfsmitteln kann man die exakte Zellzahl bestimmen?
-Hämocytometer
-Netzteilung einer Neubauer Zählkammer
-Zähluhr
-elektronisches Zählgerät
-computerunterstütze Bildanalyse
Wovon ist die Generationszeit einer Zellkultur abhängig?
-Zellen
-Zellendichte
-Zellkulturform (adhärent, Suspension, Fermenter,ect.)
-Passagenanzahl (Alter der Zellkultur)
-Medium (-Bestandteile)
-Temperatur
-Gasversorgung
Worauf ist zu achten beim Einfrieren von Zellkulturen?
Es darf zu keiner Kristallbildung oder partiellen Dehydrierung kommen
Zum Schutz: Verwendung von Gefrierschutzmitteln (z.B.: Glycerin, DMSO) und langsames Einfrieren bzw. schnelles Auftauen
Was ist eine primäre Zellkultur?
In vitro Züchtung von Zellen /Geweben/Organen die direkt aus dem Organismus entnommen werden
Was unterscheidet eine Organkultur von einer Zellkultur?
Organkultur: Erhaltung der Organ- bzw Organisationsstruktur
Zellkultur: vollständige Dissotiation des Gewebes- kultivierung einzelner Zelltypen
Was sind Eigenschaften von primären Zellkulturen und wofür werden sie verwendet?
Zellen sind genetisch stabil (d.h. keine somatischen Mutationen)
Genexpressionsstudien, Metabolismusstudien
Wie können primäre Zellkulturen hergestellt werden?
-Mechanische Dissotiation des Gewebes (Skalpell, Schere, Drahtnetze)
-enzymatisch Dissotiation (Trypsin, Collagenase, Dispase, Elastase, Hyaluronidase, DNase)
Wie gewinnt man embryonale Fibroblasten?
-Gewinnung aus trächtigen Mäusen
-Tötung der Mäuse & sterilisation mit 70% EtOH
-herausoperieren des Embryos
-Embryo in Petrischale mit PBS
-Entfernung extraembrionales Gewebe
-zerkleinern & in vorgewärmte Trypsinlösung geben
-rühren (10-15min)
-Überstand abnehmen & zentrifugieren
-Zellpelett in Kulturmedium & Trypsinbehandlung wiederholen bis DNA freigesetzt wird
-gesammelte emb. Fibroblasten in Kulturflaschen aussähen (nach 24h Medium wechseln)
Was sind Probleme bei Organkulturen?
Sauerstoffmangel, Nährstoffmangel, Entgiftung
Was sind Anwendungsmöglichkeiten von Organkulturen?
Untersuchung von Substanzen bezüglich pharmakologischer & toxikologischer Eigenschaften
Was sind Hybridomzellen?
Hybridzellen hergestellt durch Fusion aus antikörperproduzierenden Zellen (B-Zellen) & Myelomzellen (Krebszellen)
Hybridzellen haben Eigenschaften von beiden: sind imortalisiert und prozuzieren monoklonale Antikörper
Welche Stoffe können als Antigene fungieren?
particulär (z.B.: Zellen) löslich (z.B.: Proteine, Peptide)
Adjuvantien (z.B.: Al(OH)3, inaktivierte Bakterien) können Immunantwort verstärken
Aus welchen Organismen werden Zellen zur Herstellung der Hybridomzellen gewonnen?
Maus (meistens), Ratte, Mensch
Was ist ein HAT Medium und wofür wird es verwendet?
Nach Fusion von Milzzellen mit Myelomzellen erhält man nicht nur gewünschte Hybridomzellen (Myelom-milzzellen) sondern auch andere. HAT ist spezielles Kulturmedium das nur gewünschten Hybridomzellen Wachstum ermöglicht - alle anderen sterben nach gewisser Zeit ab
Wie werden Hybridomzellen Immunisiert?
erfolgt in mehreren Schritten:
für Erstimmunisierung: 150µg Antigen in 300-400µl PBS +Adjuvans
weitere Immunisierung alle 4 Wochen: 100µg Antigen in 300-400µl PBS
letzte Immunisierung: 100µg Antigen in 100-µl PBS
Wofür werden Hepatozyten als Modelsystem verwendet?
zur Beantwortung toxikologischer & pharmazeutischer Fragestellungen
Was sind die Vorteile einer Hepatozyten Zellkultur verglichen mit einer in vivo Untersuchung?
-keine Hormonschwankung
-gleich bleibende biochemische Verhältnisse
-genaue Dosierung & Expositiondauer
-deffinierte Zielzellen
-direkte Analyse der biologischen & biochemischen Effekte
Wie werden Hepatozyten isoliert?
durch Perfusin mit geeigneter Lösung (z.B.: EDTA, Collagenasen, Trypsin,...)
wichtig: ausplattieren auf Collagen beschichtete Kulturgefäße
Was sind PC-12 Zellen?
Phäochromocytomzellen: isoliert aus Tumorzellen im Nebennierenmark von Ratten
durch reversible Stimmulierung mit Nerve Growth Faktor bilden sich in Gewebekulturen neuronale Fortsätze (inclusive Bildung Neurotransmittern Noradrenalin & Dopamin) --> Analyse neurobiologischer Prozesse
