Zellbasierte Bioanalytik
Umgang mit eukaryotischen Zellen, zellbasierte Bioanalytik, Medikamentenentwicklung
Umgang mit eukaryotischen Zellen, zellbasierte Bioanalytik, Medikamentenentwicklung
Zellen werden in der Analytik als .. verwendet?
Stellvertreter (Medikamentenentwicklung oder Grundlagenforschung) oder als Indikatoren (Diagnostik, Umwelttoxikologie, Grundlagenforschung und Medikamentenentwicklung)
Qualitätskontrolle
Bakterien und Hefen kultivieren
Medienplatten (Agarbasis)
Flüssigkulturen
Verschiedene Stämme oder Spezies haben unterschiedliche Ansprüche an die
Kulturbedingungen.
Am häufigsten benutzt werden E. coli (Laborstamm K12) Bakterien und S.
cerevisiae Hefen. Wobei die Bakterien gewöhnlich bei 37°C und die Hefen bei
30°C vermehrt werden.
Die Kultivierung von Zellen aus mehrzelligen Organismen
stellt sich als schwieriger heraus, als die Kultivierung von Bakterien oder Hefen. Zellen, die normalerweise im Inneren eines Organismus leben, sind nicht direkt der Umwelt ausgesetzt, wie es die meisten Bakterien und Pilze sind. Deshalb müssen zur Kultivierung ähnliche Bedingungen hergestellt werden, wie im Körperinneren des entsprechenden Organismus. Dazu zählt bei vielen kultivierten Zellen auch die erhöhte CO2 Konzentration im Gasgemisch (meist 5 %).
Die meisten Zellen leben darüberhinaus in engem Kontakt mit anderen Zellen in oft mehrschichtigen Geweben. Ausnahmen sind z.B. Blutzellen.
Tierische Zellen kultivieren
Tierische kultivierte Zellen müssen vor Austrocknung geschützt werden. Sie verfügen im Gegensatz zu Bakterien, Pilzen und Pflanzen über keine Zellwände, die gut vor Austrocknung schützen. Das Medium von dem die Zellen umgeben sind, muss die benötigten Nährstoffe enthalten. Dies bedeutet einerseits Energiequellen, wie auch Kohlenstoff‐, Stickstoff‐, Phosphorquellen (u.a.). Nebst Energie und Chemischen Elementen, müssen den Zellen auch essentielle Stoffe zugeführt werden (Vitamine, essentielle Fettsäuren und Aminosäuren).
Verschiedene Medien
Verschiedene Zellen benötigen unterschiedliche Kulturmedien. Die verwendeten Medien richten sich aber auch nach der spezifischen Anwendung. Häufig ist Phenolrot beigemischt, das als pH Indikator angibt, wann das Medium spätestens ersetzt werden muss.
Monolayer bzw. adhärente Zellen
Traditionell werden Zellen so gehalten, dass sie an den Kulurgefässen haften (adhärent). Zu den Vorteilen, die dies mit sich bringt, zählt ein einfacher Umgang mit den Zellen beim Mediumwechsel, die einfacheren Methoden zur Beobachtung und die Tatsache, dass sich mehrere Eigenschaften der Zellen nur im adhärenten Wachstum und in engem Kontakt mit anderen Zellen ausbilden. So liegen Zellen in Suspension z.B. immer annähernd kugelförmig vor und morphologische Untersuchungen sind nur bedingt durchzuführen. Viele adhärente Zellen wachsen als einzellige Schicht und stellen das Wachstum ein, wenn die zu bewachsende Fläche gefüllt ist. Es gibt auch Zellen, die in mehreren Schichten wachsen und die Entwicklung gezielter dreidimensionaler Zellkultur (z.B. Tissue Engineering) wird vorangetrieben.
Mehrzeller – Physikalische Parameter
Neben den chemischen Parametern wie Nährstoffe und pH, sollen geeigneten Bereich gehalten werden. Zu diesem Zweck setzt man Inkubatoren ein. Diese Geräte sorgen auch für eine effektive Barriere gegen Kontamination der Zellen mit Mikroorganismen, z.B. Bakterien und Pilzen.
Inkubatoren für tierische Zellen verfügen sowohl über einen Thermostaten wie auch einen CO2 Regelkreis, der es erlaubt die benötigte CO2 Konzentration im Inkubator aufrecht zu halten. Damit die Gefässe mit den Zellen nicht austrocknen, werden Inkubatoren mittels Wasserwannen feucht gehalten. Säugerzellen werden normalerweise bei 37°C gehalten, Fischzellen teilweise bei 30°C.
Umgang mit Zellen – Steriles Arbeiten
Die Bedingungen, unter denen tierische Zellen vermehrt werden, begünstigen auch das Wachstum verschiedener Mikroorganismen. Wachstum von Bakterien, Pilzen oder Zellparasiten kann den Ausgang verschiedenster zellbasierter Experimente erheblich beeinträchtigen oder die Kultivierung der tierischen Zellen verunmöglichen. Es ist deshalb essentiell, Arbeiten an den Zellen so zu verrichten, dass keine Mikroorganismen zu den Zellkulturen gelangen. Die entsprechenden Bemühungen werden sterile Arbeitstechniken genannt.
Arbeiten an offenen Gefässen, die Zellen enthalten (oder Stoffe, die zu den Zellen gegeben werden), werden in Sterilbänken (sterile benches) durchgeführt. Luft wird durch spezielle Filtersysteme sterilisiert und über die Arbeitsfläche geblasen, sodass keine kontaminierte Luft zur Arbeitsfläche gelangen kann. Im Idealfall, ist der Luftstrom laminar, also ganz ohne Verwirbelungen. Man spricht in der Praxis von einer turbulenzarmen Verdrängungsströmung.
Routinearbeiten mit Zellen – Subkultivierung / Split
Zellen müssen subkultiviert werden, wenn die gesamte Fläche des Kulturgefässes überwachsen ist, um neuen Platz für kontinuierliches Wachstum zu schaffen. Die Zellen werden möglichst schonend unter Verwendung von Enzymen (z.B. Trypsin) vom Kulturgefäss entfernt. Die proteolytische Behandlung führt zum Bruch von Proteinbindungen über welche die Zellen an das Kulturgefäss haften. Zellen haften häufig an Kulturgefässen durch Interaktion mit divalenten Ionen (z.B. Ca2+ oder Mg2+). Diese Interaktion kann mit dem Chelator EDTA oft verhindert bzw. rückgängig gemacht werden.
Kryopreservation
Zellen, die für längere Zeit nicht verwendet werden, müssen nicht kontinuierlich in Kultur gehalten werden. Es ist möglich die Zellen einzufrieren und praktisch beliebig lange in Flüssigstickstoff aufzubewahren. Gefrorene Aliquots dienen auch als Versicherung, für den Fall, dass ein Missgeschick die Zellen unbrauchbar macht. Daneben durchlaufen auch kultivierte Zellen einen gewissen Alterungsprozess, was den regelmässigen Ersatz durch «jüngere» Zellen bedingt.
Zellen können in speziellen Medien eingefroren werden. Beigefügte Substanzen wie DMSO oder Glyzerin helfen die Zellen zu dehydrieren und vermindern das Risiko der Bildung von zellinternen Eiskristallen, die die inneren Strukturen der Zellen zerstören können.
Etablierung einer Zellkultur
Zellen, die direkt aus einem Gewebe in Kultur genommen werden (Primärkultur), teilen sich in der Regel nur noch wenige Male. Nach kurzer Zeit können solche Zellen nicht mehr für reproduzierbare Experimente genutzt werden. Durch Veränderungen im Expressionsmuster der Zellen, kann diese Hürde überwunden werden.
Einige Tumorzellen sind bereits im Gewebe immortalisiert. Andere Primärzellen werden künstlich durch Fusion mit Tumorzellen oder die Expression von bestimmten Genen (z.B. durch virale Infektion) transformiert. Transformationen können sich auch spontan in Kultur ereignen.
Hauptsächlich werden Zellen als Stellvertreter oder als Indikatoren eingesetzt. Grundsätzlich geht darum, eine Veränderung der Zellen (Reaktion) durch einen experimentellen Eingriff verglichen zur Kontrolle, zu messen. (Auch die Wirkung der Zellen auf ein Substrat kann untersucht werden –Transport, Verstoffwechslung) Zur Auswahl des zu beobachtenden Parameters lohnt sich eine Aufstellung einiger Eigenschaften von Zellen.
• Morphologische (‘anatomische’) Eigenschaften
• Genexpression (Proteom)
• Physikalische Eigenschaften
• Biochemische Eigenschaften
Heute lassen sich die meisten dieser Eigenschaften quantitativ bestimmen
Verschiedene Interaktionen werden untersucht:
• Protein‐Protein
• Protein‐DNA
• Protein‐anderen intrazelluläre Moleküle
• Protein‐Chemische Verbindungen
• DNA‐Chemische Verbindungen
• Wirkung von Wärme, pH, Spannung und mechanischer Belastung
Für das Auslesen der erzeugten Signale können u.a. folgende physikalische Eigenschaften quantitativ (und qualitativ) gemessen werden:
• Fluoreszenz
• Absorption
• Membranpotenzial
• Mechanischer Widerstand
• pH (Medium)
• Lumineszenz
• Elektrische Impedanz
• Radioaktivität
• Sauerstoff (Medium)
• Form u.a. (Mikroskopie)
Zellbasierte Bioanalytik: Prinzipielles Schema
Siehe Bild
Einfachster denkbarer Versuch
Anwendungsfeld: Toxikologie, akute Zelltoxizität
Eigenschaften von Zellen: Lebendig / tot bzw. Wachstum
Interaktionen: Egal
physikalische Eigenschaft: pH Medium
Readout: Farbe des pH‐Indikators im Medium, bzw. Absorption bei def. Wellenlänge
Entwicklung eines zellbasierten Assays:
• Wahl der Zellen 6
Primärzellen, Kultivierte Zellen, Transgene
• Auslesen der Zellantwort 4
Indikatoren entlang der Signalkaskade, Morphologie, Tod
• Assay zur Messung der Zellantwort 5
ELISA, Fluoreszenzfarbstoffe, FRET, Lumineszenz, Absorption
Dies sind nur drei wichtige Kriterien. Dazu kommen noch weitere detaillierte Entscheidungen betreffend Format, Anwendung und Auswertung
Prozess der Medikamentenentwicklung
Siehe Bild
Compound Screening im Zusammenhang: Vom Symptom zur Behandlungsstrategie
Einige Krankheiten lassen sich noch immer nicht ursächlich behandeln..
Symptom: Schwere Dehydration
Behandlung: Zufuhr von Wasser, Salzen und Zucker
Analyse: Durchfall hat zu Dehydration geführt
Behandlung: Durchfall medikamentös stoppen
Analyse: Cholerabakterien haben zum Durchfall hat geführt
Behandlung: Antibiotika verabreichen, die die Bakterien töten
Prophylaxe: Impfung und Verbesserung der Hygiene
Aufstellung der häufigsten Zielproteine für die Medikamentenentwicklung
Rezeptoren
Enzyme
Transporter
Das Verständnis verschiedener physiologischer Vorgänge und deren krankheitsbedingter Veränderungen auf molekularer Ebene, ermöglicht es, gezielt nach Verbindungen zu suchen, die die entsprechenden Zielmoleküle beeinflussen können.
Siehe Bild
Schon vor der Entwicklung moderner synthetischer Methoden, die es erlauben, eine Vielzahl chemischer Verbindungen parallel herzustellen (z.B. kombinatorische Chemie), verfügten Pharmazeutische Firmen über Verbindungsbibliotheken (compound libraries) mit möglichst unterschiedlichen Vebindungstypen. Daneben wurden auch Isolate aus der Natur (Pflanzenextrakte, Metaboliten von Pilzen und Bakterien) gesammelt.
Siehe Bild
Das Ziel der zellbasierten Analytik in der Medikamentenentwicklung ist es:
den Nachweis der Interaktion der Verbindungen mit den Zielmolekülen auf eine zeitsparende und kostengünstige Art zu erbringen. Zellen mit zielmolekül‐spezifischen Reaktionen erfüllen diese Ansprüche und erlauben entsprechende Tests in kleinvolumigen Formaten im «Hochdurchsatz » (High Throughput).
Die zunehmende Miniaturisierung der zellbasierten Assay führt dazu, dass immer mehr Verbindungen pro Lesevorgang evaluiert werden können. Daneben verringert sich die benötigte Wirkstoffmenge pro Versuch.
Nichtselektiver Kationenkanal TRPV1
TRPV1 reagiert auf Hitze, Ansäuerung und Liganden wie Capsaizin (Chilli) und vermittelt die entsprechende Signalübertragung zur Empfindung dieser Reize.
TRPV1 gilt als Zielmolekül für die Behandlung der Übermittlung und Integration von Schmerzempfindungen.
Prüfung von TRPV1 Antagonisten
Ein Schmerzmittel, das alle Reize unterdrückt, die über TRPV1 vermittelt werden, sollte das Öffnen dieses Kanals behindern (Antagonist). Als leicht zu beschaffender Ligand für Experimente kann Capsaizin eingesetzt werden.
Der Unterbruch des Kationenflusses durch den Ionenkanal trotz Anwesenheit eines stimulierenden Agens ist ein mögliches Indiz für die Funktion des Antagonisten.
Da Messungen an einzelnen, isolierten Kanälen sehr schwierig zu realisieren sind, wird die Funktion der Kanäle in lebenden Zellen untersucht.
Die Reaktion der Zelle soll die Reaktion des Ionenkanals repräsentieren.
Wahl der Zellen (TRPV1 Antagonisten)
Um ein möglichst grosses Signal zu erzeugen, das vom Zielprotein kommt, wird dieses Protein in kultivierbaren Zellen überexprimiert (d.h. in einem höheren Mass, als «normal»). Das erfolgt meist durch Einschleusen des entsprechenden Gens unter Kontrolle eines starken Promoters.
Detektion des Ionenflusses (TRPV1 Antagonisten)
Es gibt einige membrangängige Fluoreszenzfarbstoffe, die Ca2+‐abhängig ihre Fluoreszenzeigenschaften ändern.
Dies ermöglicht eine direkte Beobachtung der intrazellulären Ca2+‐Konzentration bzw. der Kinetik des Ionenflusses.
Die zu untersuchenden Zellen werden zuerst mit dem Ca2+‐abhängigen Fluoreszenzfarbstoff beladen. Danach kann der Ca2+‐Einstrom durch den Liganden (hier Capsaizin) ausgelöst werden.
Stellvertretterschema
Siehe Bild
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Cartes-fiches
Zellen werden in der Analytik als .. verwendet?
Stellvertreter (Medikamentenentwicklung oder Grundlagenforschung) oder als Indikatoren (Diagnostik, Umwelttoxikologie, Grundlagenforschung und Medikamentenentwicklung)
Qualitätskontrolle
Bakterien und Hefen kultivieren
Medienplatten (Agarbasis)
Flüssigkulturen
Verschiedene Stämme oder Spezies haben unterschiedliche Ansprüche an die
Kulturbedingungen.
Am häufigsten benutzt werden E. coli (Laborstamm K12) Bakterien und S.
cerevisiae Hefen. Wobei die Bakterien gewöhnlich bei 37°C und die Hefen bei
30°C vermehrt werden.
Die Kultivierung von Zellen aus mehrzelligen Organismen
stellt sich als schwieriger heraus, als die Kultivierung von Bakterien oder Hefen. Zellen, die normalerweise im Inneren eines Organismus leben, sind nicht direkt der Umwelt ausgesetzt, wie es die meisten Bakterien und Pilze sind. Deshalb müssen zur Kultivierung ähnliche Bedingungen hergestellt werden, wie im Körperinneren des entsprechenden Organismus. Dazu zählt bei vielen kultivierten Zellen auch die erhöhte CO2 Konzentration im Gasgemisch (meist 5 %).
Die meisten Zellen leben darüberhinaus in engem Kontakt mit anderen Zellen in oft mehrschichtigen Geweben. Ausnahmen sind z.B. Blutzellen.
Tierische Zellen kultivieren
Tierische kultivierte Zellen müssen vor Austrocknung geschützt werden. Sie verfügen im Gegensatz zu Bakterien, Pilzen und Pflanzen über keine Zellwände, die gut vor Austrocknung schützen. Das Medium von dem die Zellen umgeben sind, muss die benötigten Nährstoffe enthalten. Dies bedeutet einerseits Energiequellen, wie auch Kohlenstoff‐, Stickstoff‐, Phosphorquellen (u.a.). Nebst Energie und Chemischen Elementen, müssen den Zellen auch essentielle Stoffe zugeführt werden (Vitamine, essentielle Fettsäuren und Aminosäuren).
Verschiedene Medien
Verschiedene Zellen benötigen unterschiedliche Kulturmedien. Die verwendeten Medien richten sich aber auch nach der spezifischen Anwendung. Häufig ist Phenolrot beigemischt, das als pH Indikator angibt, wann das Medium spätestens ersetzt werden muss.
Monolayer bzw. adhärente Zellen
Traditionell werden Zellen so gehalten, dass sie an den Kulurgefässen haften (adhärent). Zu den Vorteilen, die dies mit sich bringt, zählt ein einfacher Umgang mit den Zellen beim Mediumwechsel, die einfacheren Methoden zur Beobachtung und die Tatsache, dass sich mehrere Eigenschaften der Zellen nur im adhärenten Wachstum und in engem Kontakt mit anderen Zellen ausbilden. So liegen Zellen in Suspension z.B. immer annähernd kugelförmig vor und morphologische Untersuchungen sind nur bedingt durchzuführen. Viele adhärente Zellen wachsen als einzellige Schicht und stellen das Wachstum ein, wenn die zu bewachsende Fläche gefüllt ist. Es gibt auch Zellen, die in mehreren Schichten wachsen und die Entwicklung gezielter dreidimensionaler Zellkultur (z.B. Tissue Engineering) wird vorangetrieben.
Mehrzeller – Physikalische Parameter
Neben den chemischen Parametern wie Nährstoffe und pH, sollen geeigneten Bereich gehalten werden. Zu diesem Zweck setzt man Inkubatoren ein. Diese Geräte sorgen auch für eine effektive Barriere gegen Kontamination der Zellen mit Mikroorganismen, z.B. Bakterien und Pilzen.
Inkubatoren für tierische Zellen verfügen sowohl über einen Thermostaten wie auch einen CO2 Regelkreis, der es erlaubt die benötigte CO2 Konzentration im Inkubator aufrecht zu halten. Damit die Gefässe mit den Zellen nicht austrocknen, werden Inkubatoren mittels Wasserwannen feucht gehalten. Säugerzellen werden normalerweise bei 37°C gehalten, Fischzellen teilweise bei 30°C.
Umgang mit Zellen – Steriles Arbeiten
Die Bedingungen, unter denen tierische Zellen vermehrt werden, begünstigen auch das Wachstum verschiedener Mikroorganismen. Wachstum von Bakterien, Pilzen oder Zellparasiten kann den Ausgang verschiedenster zellbasierter Experimente erheblich beeinträchtigen oder die Kultivierung der tierischen Zellen verunmöglichen. Es ist deshalb essentiell, Arbeiten an den Zellen so zu verrichten, dass keine Mikroorganismen zu den Zellkulturen gelangen. Die entsprechenden Bemühungen werden sterile Arbeitstechniken genannt.
Arbeiten an offenen Gefässen, die Zellen enthalten (oder Stoffe, die zu den Zellen gegeben werden), werden in Sterilbänken (sterile benches) durchgeführt. Luft wird durch spezielle Filtersysteme sterilisiert und über die Arbeitsfläche geblasen, sodass keine kontaminierte Luft zur Arbeitsfläche gelangen kann. Im Idealfall, ist der Luftstrom laminar, also ganz ohne Verwirbelungen. Man spricht in der Praxis von einer turbulenzarmen Verdrängungsströmung.
Routinearbeiten mit Zellen – Subkultivierung / Split
Zellen müssen subkultiviert werden, wenn die gesamte Fläche des Kulturgefässes überwachsen ist, um neuen Platz für kontinuierliches Wachstum zu schaffen. Die Zellen werden möglichst schonend unter Verwendung von Enzymen (z.B. Trypsin) vom Kulturgefäss entfernt. Die proteolytische Behandlung führt zum Bruch von Proteinbindungen über welche die Zellen an das Kulturgefäss haften. Zellen haften häufig an Kulturgefässen durch Interaktion mit divalenten Ionen (z.B. Ca2+ oder Mg2+). Diese Interaktion kann mit dem Chelator EDTA oft verhindert bzw. rückgängig gemacht werden.
Kryopreservation
Zellen, die für längere Zeit nicht verwendet werden, müssen nicht kontinuierlich in Kultur gehalten werden. Es ist möglich die Zellen einzufrieren und praktisch beliebig lange in Flüssigstickstoff aufzubewahren. Gefrorene Aliquots dienen auch als Versicherung, für den Fall, dass ein Missgeschick die Zellen unbrauchbar macht. Daneben durchlaufen auch kultivierte Zellen einen gewissen Alterungsprozess, was den regelmässigen Ersatz durch «jüngere» Zellen bedingt.
Zellen können in speziellen Medien eingefroren werden. Beigefügte Substanzen wie DMSO oder Glyzerin helfen die Zellen zu dehydrieren und vermindern das Risiko der Bildung von zellinternen Eiskristallen, die die inneren Strukturen der Zellen zerstören können.
Etablierung einer Zellkultur
Zellen, die direkt aus einem Gewebe in Kultur genommen werden (Primärkultur), teilen sich in der Regel nur noch wenige Male. Nach kurzer Zeit können solche Zellen nicht mehr für reproduzierbare Experimente genutzt werden. Durch Veränderungen im Expressionsmuster der Zellen, kann diese Hürde überwunden werden.
Einige Tumorzellen sind bereits im Gewebe immortalisiert. Andere Primärzellen werden künstlich durch Fusion mit Tumorzellen oder die Expression von bestimmten Genen (z.B. durch virale Infektion) transformiert. Transformationen können sich auch spontan in Kultur ereignen.
Hauptsächlich werden Zellen als Stellvertreter oder als Indikatoren eingesetzt. Grundsätzlich geht darum, eine Veränderung der Zellen (Reaktion) durch einen experimentellen Eingriff verglichen zur Kontrolle, zu messen. (Auch die Wirkung der Zellen auf ein Substrat kann untersucht werden –Transport, Verstoffwechslung) Zur Auswahl des zu beobachtenden Parameters lohnt sich eine Aufstellung einiger Eigenschaften von Zellen.
• Morphologische (‘anatomische’) Eigenschaften
• Genexpression (Proteom)
• Physikalische Eigenschaften
• Biochemische Eigenschaften
Heute lassen sich die meisten dieser Eigenschaften quantitativ bestimmen
Verschiedene Interaktionen werden untersucht:
• Protein‐Protein
• Protein‐DNA
• Protein‐anderen intrazelluläre Moleküle
• Protein‐Chemische Verbindungen
• DNA‐Chemische Verbindungen
• Wirkung von Wärme, pH, Spannung und mechanischer Belastung
Für das Auslesen der erzeugten Signale können u.a. folgende physikalische Eigenschaften quantitativ (und qualitativ) gemessen werden:
• Fluoreszenz
• Absorption
• Membranpotenzial
• Mechanischer Widerstand
• pH (Medium)
• Lumineszenz
• Elektrische Impedanz
• Radioaktivität
• Sauerstoff (Medium)
• Form u.a. (Mikroskopie)
Zellbasierte Bioanalytik: Prinzipielles Schema
Siehe Bild
Einfachster denkbarer Versuch
Anwendungsfeld: Toxikologie, akute Zelltoxizität
Eigenschaften von Zellen: Lebendig / tot bzw. Wachstum
Interaktionen: Egal
physikalische Eigenschaft: pH Medium
Readout: Farbe des pH‐Indikators im Medium, bzw. Absorption bei def. Wellenlänge
Entwicklung eines zellbasierten Assays:
• Wahl der Zellen 6
Primärzellen, Kultivierte Zellen, Transgene
• Auslesen der Zellantwort 4
Indikatoren entlang der Signalkaskade, Morphologie, Tod
• Assay zur Messung der Zellantwort 5
ELISA, Fluoreszenzfarbstoffe, FRET, Lumineszenz, Absorption
Dies sind nur drei wichtige Kriterien. Dazu kommen noch weitere detaillierte Entscheidungen betreffend Format, Anwendung und Auswertung
Prozess der Medikamentenentwicklung
Siehe Bild
Compound Screening im Zusammenhang: Vom Symptom zur Behandlungsstrategie
Einige Krankheiten lassen sich noch immer nicht ursächlich behandeln..
Symptom: Schwere Dehydration
Behandlung: Zufuhr von Wasser, Salzen und Zucker
Analyse: Durchfall hat zu Dehydration geführt
Behandlung: Durchfall medikamentös stoppen
Analyse: Cholerabakterien haben zum Durchfall hat geführt
Behandlung: Antibiotika verabreichen, die die Bakterien töten
Prophylaxe: Impfung und Verbesserung der Hygiene
Aufstellung der häufigsten Zielproteine für die Medikamentenentwicklung
Rezeptoren
Enzyme
Transporter
Das Verständnis verschiedener physiologischer Vorgänge und deren krankheitsbedingter Veränderungen auf molekularer Ebene, ermöglicht es, gezielt nach Verbindungen zu suchen, die die entsprechenden Zielmoleküle beeinflussen können.
Siehe Bild
Schon vor der Entwicklung moderner synthetischer Methoden, die es erlauben, eine Vielzahl chemischer Verbindungen parallel herzustellen (z.B. kombinatorische Chemie), verfügten Pharmazeutische Firmen über Verbindungsbibliotheken (compound libraries) mit möglichst unterschiedlichen Vebindungstypen. Daneben wurden auch Isolate aus der Natur (Pflanzenextrakte, Metaboliten von Pilzen und Bakterien) gesammelt.
Siehe Bild
Das Ziel der zellbasierten Analytik in der Medikamentenentwicklung ist es:
den Nachweis der Interaktion der Verbindungen mit den Zielmolekülen auf eine zeitsparende und kostengünstige Art zu erbringen. Zellen mit zielmolekül‐spezifischen Reaktionen erfüllen diese Ansprüche und erlauben entsprechende Tests in kleinvolumigen Formaten im «Hochdurchsatz » (High Throughput).
Die zunehmende Miniaturisierung der zellbasierten Assay führt dazu, dass immer mehr Verbindungen pro Lesevorgang evaluiert werden können. Daneben verringert sich die benötigte Wirkstoffmenge pro Versuch.
Nichtselektiver Kationenkanal TRPV1
TRPV1 reagiert auf Hitze, Ansäuerung und Liganden wie Capsaizin (Chilli) und vermittelt die entsprechende Signalübertragung zur Empfindung dieser Reize.
TRPV1 gilt als Zielmolekül für die Behandlung der Übermittlung und Integration von Schmerzempfindungen.
Prüfung von TRPV1 Antagonisten
Ein Schmerzmittel, das alle Reize unterdrückt, die über TRPV1 vermittelt werden, sollte das Öffnen dieses Kanals behindern (Antagonist). Als leicht zu beschaffender Ligand für Experimente kann Capsaizin eingesetzt werden.
Der Unterbruch des Kationenflusses durch den Ionenkanal trotz Anwesenheit eines stimulierenden Agens ist ein mögliches Indiz für die Funktion des Antagonisten.
Da Messungen an einzelnen, isolierten Kanälen sehr schwierig zu realisieren sind, wird die Funktion der Kanäle in lebenden Zellen untersucht.
Die Reaktion der Zelle soll die Reaktion des Ionenkanals repräsentieren.
Wahl der Zellen (TRPV1 Antagonisten)
Um ein möglichst grosses Signal zu erzeugen, das vom Zielprotein kommt, wird dieses Protein in kultivierbaren Zellen überexprimiert (d.h. in einem höheren Mass, als «normal»). Das erfolgt meist durch Einschleusen des entsprechenden Gens unter Kontrolle eines starken Promoters.
Detektion des Ionenflusses (TRPV1 Antagonisten)
Es gibt einige membrangängige Fluoreszenzfarbstoffe, die Ca2+‐abhängig ihre Fluoreszenzeigenschaften ändern.
Dies ermöglicht eine direkte Beobachtung der intrazellulären Ca2+‐Konzentration bzw. der Kinetik des Ionenflusses.
Die zu untersuchenden Zellen werden zuerst mit dem Ca2+‐abhängigen Fluoreszenzfarbstoff beladen. Danach kann der Ca2+‐Einstrom durch den Liganden (hier Capsaizin) ausgelöst werden.
Stellvertretterschema
Siehe Bild
