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Tierphysio Teil 2

Gene

Gene

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L. H.
Étudier
L. H.
Diese Lernkarten bieten einen Überblick über fortgeschrittene Techniken der Tierphysiologie auf Universitätsniveau. Sie behandeln zentrale Themen wie DNA-Fragmente, Proteine, Gene und Klonierung, wobei spezifische Methoden wie Golden Gate Assembly, Gibson Assembly und Restriktionsverdau im Fokus stehen. Die Karteikarten erklären auch die Regulation der Genexpression, die Rolle von Promotoren und die Kontrolle der Proteinproduktion. Besonders nützlich sind sie für Studierende und Forscher, die sich mit molekularer Biologie und genetischer Engineering beschäftigen, da sie fundierte Einblicke in die praktische Anwendung dieser Techniken bieten.
Cartes-fiches
11
Utilisateurs
2
Langue
Allemand
Catégorie
Biologie
Niveau
Université
Créé / Mis à jour
27.01.2015 / 25.11.2015
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Cartes-fiches

menschliches Genom

  • 3164,7 Millionen Basen
  • 50% repetitive DNA
  • ~20.000 Gene (2%)
  • 2-3x soviele Proteine
  • Durchschnittsgröße pro Gen: 30 kb
  • Durchschnittszahl an Exons: 4
  • Expression benötigt:
    • Transkriptionsfaktor muss binden
    • Interaktionen zwischen TF und Cofaktoren
    • Bindung der TF ist stark abhängig von der 3D-Struktur des Chromatins

Promotoren

  • Core Promoter: Region, die verantwortlich ist für das Binden des TF-Apparates, etwa 35bp upstream der Transcription start site (TSS)
  • Proximal Promoter: Region, mit mehreren regulatorischen Elementen, einige 100 bp upstream des TSS
  • Distal Promoter: zusätzliche regulatorische Elemente (Enhancer, Silencer) mehrere 1000bp upstream der TSS
  • TATA-box (GOldberg-Hogness box) 5'-TATAAA-3'
    • häufig anzufinden in Spezies wie Hefe, weniger häufig in Säugetieren + Pflanzen
    • etwa 10% der menschl. Gene
    • assoziiert mit Gewebespezifischen Genen
  • CpG island
    • hauptsächliche Promotoren von Säugern
    • Assoziiert mit housekeeping-Genen
    • diese Promotoren haben gewöhnlich keine TATA box und einen alternativen Startpunkt

Kontrolle der Genexpression

  • Einheiten
  • Regulation der Genexpression über mehrere Level
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  • TF-binding-sites werden in größeren DNA-EInheiten gefunden, den cis-regulatorischen ELementen
    • Promotoren
    • Enhancer
  • mehrere Level an Genregulation
    • Gentranskription (welche Gene werden transkribiert, in welcher Geschw.)
    • Nukleare RNA-Prozessierung (welche nukleare RNA wird mRNA)
    • mRNA Transport (welche sind stabil, werden aus Nukleus transportiert)
    • mRNA Translation
    • Protein-Modifikation
    • Protein-Degradierung

mehrere Splice-Varianten

z.B. CD55

  • gDAF: Glycosyl phosphatidylinosiol (GPI)-verankert, Membrangebundenes Protein: starker Gegenspieler auf der Zelloberfläche
  • sDAF: lösliches Protein: effizienterer Inhibitor in der flüssigen Phase
  • mehrere kleinere Isoformen von gDAF und sDAF
    • alle Isoformen werden allgegenwärtig exprimiert, aber Gewebespezifische Variationen

Fundamentale rekombinante DNA-Techniken

  • Weitergabe von DNA-Fragmenten an Bakterien oder Hefen
    • molekulares Cloning
      • Restriktionsverdau
      • Gelelektrophorese
      • DNA-Ligation
      • Bakterielle Klonierungsvektoren (Plasmid, Bakteriophage)
      • Yeast artificial Chromosome (YAC)
      • Transformation/Transduktion
      • Wachstum
    • DNA-Quellen
      • Purifikation von genomischer DNA
      • Reverse Transkription von mRNA
      • PCR
      • CHem. Synthese von DNA, wenn die Sequenz bekannt ist

Für die Produkton von rekombinanter DNA-Konstrukten zur Expression in Eukaryoten braucht man ein Verständnis von:

  • Genstruktur
  • Regulation der Genexpression
  • Transkription
  • Codon-Gebrauch

Restriktionsverdau

  • Restriktionsenzyme (oder Restriktions-Endonukleasen)
    • aus Bakterien
    • Verteidigungsmechanismen gegen Fremd-DNA (Viren)
  • EcoRI:
    • Restriktionsenzym, das an den Sticky-Ends schneidet
  • SmaI:
    • Restriktionsenzym, das an den Blunt-Ends schneidet
  • T4-Polymerase: 
    • ABstumpfung der 5' overhangs
  • Klenow:
    • Abstumpfung der 3' overhangs

  • Gate cloning (Invitrogen)
  • Recombineering

  • phiC31 integrase ist eine Sequenzspezifische Phagen-Rekombinase, die zwei kurze DNA-Sequenzen (attB + attP) rekombiniert
  • Remkombination-unterstütztes Engineering in E.coli, mithilfe der lambda-phage
    • PCR-Amplifikation eines Fragments, welches von kurzen Regionen homolog zum Ziel flankiert ist
    • Zielgen in bacterial artificial chromosome - BAC
    • BAC transformiert in Bakterienstamm
      • lambda phage Redalpha und Redbeta Gene unter starkem Promotor
      • Expresson blockiert von Temperatur-sensitiven Repressoren
      • bei 32°C ist die Expression blockiert
    • Selektion der Klone, die BAC tragen
    • PCR-Fragment in Klone transformieren
      • Temperaturerhöhung auf 42°C destabilisiert Repressoren
      • Redalpha + Redbeta werden exprimiert
      • homologe Rekombination wird katalysiert
    • Recombinanten in vivo generiert --> Detektion über Selektion

Gibson Assembly

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  • Gibson Assembly ist eine isothermale, single-reaction Methode, um mehrere überlappende DNA-Fragmente zu verbinden
  1. Primer designen
  2. PCR
  3. Gibson Assembly

Type IIS Enzyme

  • DNA außerhalb der zu erkennenden Sequenz schneiden
  • so viele verschiedene Overhangs in einem Tube generieren (mit einem Enzym) wie man will
  • Die Recognition-Site ist nicht palindromic und dadurch directional

Golden Gate Assembly

  • Golden Gate Cloning beruft sich auf eine spezifische Enzymfamilie, die IIS ENzyme
  • IIS Enzyme schneiden die DNA außerhalb der recognition Loci, unabhängig von der Sequenz
  • --> dadurch können viele verschiedene Overhangs kreiert werden (mit einem Enzym in einem Tube)
  • --> das Fragment kann engineert werden, wodurch es nicht noch einmal geschnitten werden kann sobald es ligiert ist

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