Spektroskopie

Ein Multi Channel Plate-Detektor (MPC) funktioniert nach dem Prinzip des SEV (Sekundärelektronenvervielfacher). Dabei sind mehrere SEV-Einheiten zusammengebaut, was die Sensitivität erhöht und eine räumliche Auflösung ermöglicht. Der Ionenstrahl trifft dabei in einen kleinen Kanal, der mit einem Halbleiter beschichtet ist. Die auftreffenden Ionen schlagen dabei weitere Elektronen los, die an anderer Stelle wiederrum weitere Elektronen herausschlagen. Die Anzahl Elektronen wächst dabei lawinenartig an, was zu einem sehr starken Endsignal für jedes detektierte Ion führt. Ein Kanal entspricht dabei einem SEV.

Die Matrix bildet bei der Ionisation ein Plasma, über welches die Ladungen auf die
Analytmoleküle übertragen werden. Sie besteht aus einem Chromophor, der bei einer
bestimmten Wellenlänge Licht absorbiert. Der beim MALDI eingesetzte LASER strahlt
genau mit dieser Wellenlänge ein.

Bei der Matrix Asocieted Laser Desorption/Ionisation wird die Probe in eine Matrix aus
Sinapinsäure oder Dihydroxibenzoesäure eingebettet. Die Analytmoleküle müssen dabei
Teil des Kristallgitters sein.

TOF bedeutet Time Of Flight. Die unterschiedlichen Ionen werden durch eine Pulsquelle
beschleunigt, wobei sie alle die gleiche kinetische Energie erhalten. Anschliessend
legen sie eine definierte Flugstrecke zurück, an deren Ende der Detektor sitzt. Schwerere
Ionen gelangen dadurch verspätet zum Detektor, leichtere früher da sie um, die
gleiche kinetische Energie zu besitzen, eine höhere Geschwindigkeit haben müssen

Das Reflektron besteht aus mehreren Ionenspiegeln, die geringe Geschwindigkeitsdifferenzen
zwischen gleichen Ionen durch Spiegelung ausgleichen. Damit wird die Auflösung
erhöht. Zum Einsatz kommt dieses System im Massenseparator eines MALDISpektrometers.

Die Auflösung ist definiert als: R = m/ Δm
Die Auflösung ist gut wenn die Ausschläge basisliniengetrennt sind.

Die Genauigkeit ist definiert als:
D_m = m_real- m_measured
Die Genauigkeit ist gut, wenn die Differenz gegen Null geht.

Die verschiedenen Ionen bzw. Fragmente befinden sich eingeschlossen in einem Spannungsfeld,
das von einer Wechselspannungsquelle gespeist wird. Durch kurzzeitige
Schwankungen der Wechselspannung (Pulse, Dauer: 0.1 s) werden Ionen nach m/z
aussortiert

Die Ion Trap deckt einen Massenbereich bis 40'000 m/z ab.
Für die Analyse grosser Biomoleküle bietet sich MALDI oder ESI an.

Bis 3000 m/z.

Für Biomoleküle (bsp. Proteine) von ca. 200'000-500'000 m/z.

Die ESI-Spektren sind etwas komplexer als die MALDI-Spektren, da bei der ESI die verschiedenen
Ionen unterschiedlich viele Ladungen tragen. Dies führt zu unterschiedlichen
m/z-Verhältnissen und damit zu mehr Ausschlägen im Spektrum. Bei der MALDIMethode
gibt es neben wenigen kleinen Ausschlägen nur einen Hauptausschlag.

MALDI, FAB, ESI

Ein Quadrupol besteht aus vier Stabelektroden, die im Querschnitt quadratisch angeordnet
sind. Dabei liegen auf den diagonal gegenüberliegenden Stabelektroden je eine
positive und eine negative Gleichspannung an. Darüber hinaus wird über die beiden
paare eine Wechselspannung angelegt, die zwischen den Paaren um 180° phasenverschoben
ist. Die Ionen werden durch Änderung der Spannung und der Frequenz
separiert

Das Vakuum verhindert, dass Ionen mit Gasmolekülen aus der Luft kollidieren. Die
Kollisionen würden den Ionenstrahl ablenken oder zu unerwünschten Fragmentierungen
führen.

Das Kollisionsgas (Inertgas N2 oder He) bewirkt im zweiten Quadrupol weitere Fragmentierungen,
ohne dass es an etwaigen Reaktionen teilnimmt. Flüssigkeiten wären
zu dicht und würden den Ionenstrahl absorbieren. Ausserdem wäre das Einleiten von
Flüssigkeiten in das Vakuum problematisch.

Masse pro Ladung

200 – 700 nm

Kurz zusammengefasst ist es die Gesamtanregung/emittiertes Licht. Die Quantenausbeute wird mit einer komplizierten Formel berechnet. Je höher sie ist, umso effizienter strahlt ein Stoff Licht wieder ab. Zusätzlich ist die Quantenausbeute ein wesentlicher Bestandteil des erweiterten Lambert-Beer Gesetzes in der Fluoreszenzspektroskopie.

Ein Intersystem Crossing findet vor einer Phosphoreszenz statt. Dabei wird ein angeregtes Elektron in einen schwingungsangeregten angeregten Zustand bei gleichzeitiger Spinumkehr angehoben.

Nujol ist ein Öl, welches man verwendet um viskose Substanzen auf eine Platte zu schmieren damit man sie im IR messen kann. Achtung: Nujol ist im IR nicht unsichtbar und muss daher nachher aus dem Spektrum wieder raussubtrahiert werden. ATR wäre vorteilhafter.

Aus geschliffenem Quarzglas oder aus Kunststoff (Einmalküvetten)

Beim UV/VIS Spektrometer wird mit zwei Lampen UV Licht (Deuteriumlampe) und visuelles Licht (Wolfram oder Halogenlampe) auf einen Spiegel gestrahlt. Aus dem so zusammengeführten UV/Vis Licht wird das IR Licht herausgefiltert. Das Licht trifft auf den Chopper. Dies ist ein beweglicher Spiegel, mit welchem das Licht entweder zur Probe oder zur Referenz hin geleitet werden kann. So können Probe und Referenz gleichzeitig gemessen werden.

Sie müssen aus Materialien bestehen, die nicht im IR Bereich absorbieren (KBr, NaCl, bei IR und ZnSe, Ge oder Diamant bei ATR)

Ja, Quantifizierung ist möglich. Dazu muss eine Kalibrationskurve erstellt werden. Am einfachsten ist es, wenn die Substanz in Lösung gebracht wird. Dabei muss aber darauf geachtet werden, dass das Lösungsmittel im IR nicht absorbiert (also kein Wasser nehmen) und die Küvetten nicht auflöst.

1. KBr wird unter hohem Druck flüssig, deswegen lässt sich aus der mit KBr verriebenen Probe leicht eine Pille pressen, die dann in den Strahl des IR Spektrometers eingeführt wird.

2. KBr ist im IR unsichtbar.

Fluoreszenz: 1-100 ns

Phosphoreszenz 10^-3 bis 100 s

Die Wellenzahl ist der reziproke Wert der Wellenlänge.

Das Gesetz gilt in der Photometrie bei homogener Verteilung der Substanz und niedrig konzentrierten Lösungen. Es gilt nicht in der Massenspektrometrie. (UV/Vis, IR)

Absorption = spezifischer molarer Extinktionskoeffizient * Konzentration * Pfadlänge in der Probe