Protein-Reinigung und Expression

pQE-30 Xa

• Expression in E.coli
• Hexahistidin-Tag
• Zwischen His-Tag und MCS ist eine Erkennungstelle für eine Faktor-10a Protease --> Tag kann nach der Isolation abgespalten werden
• Doppelter Lac-Operator hält die Basalexpression niedrig, induzierbares Expressionssystem mit strikter Expressionskontrolle

pET

• T7 Promotor
  • Hohe Selektivität der T7 Polymerase
  • Hohe Expressionsrate der T7 Polymerase
  • Niedrige Basaltranskription
• Induzierbarkeit mit IPTG (Isopropyl-β-thiogalactosid)
  Bindet an LacI Repressor, der dann Lac-Operator frei gibt

Kombination aus Expressionsvektor und geeignetem Wirt. Auswahl hängt von Anwendung ab.

Am häufigsten verwendeter Organismus ist E.coli. Fast alle Labor-Stämme gehen auf E.coli K-12 zurück.

Vorteile

• Viel Erfahrung
• Große Auswahl an Klonierungsvektoren
• Proteinexpression leicht kontrollierbar
• Hohe Ausbeute
• Billige Kultivierung

Nachteile

• Keine Modifikationen nach der Translation möglich
• Biologische Aktivität kann von nativem Protein abweichen
• Hoher Gehalt an Endotoxinen in gram-negativen ABkterien
• Produkt evt. Schwer löslich (inclusion bodies)

Inclusion bodies sind dichte granuläre Strukturen durch Akkumulation von hohen Mengen an inaktivem Protein.

• Denaturierte Proteine bilden Intermediate mit hydrophoben Oberflächen (erst bei nativer Faltung innen)
• Zusammenschluss von hydrophoben Bereichen mehrere Proteine
• können sich nicht weiter falten
• inaktiv

Vermeidung: keine Überexpression (nicht zu lange, weniger IPTG, geringere Temperatur)

pET-Vektor mit speziellem E.Coli Stamm.

• E-Coli hat Gen zur Expression von T7 RNA Polymerase im Chromosom (von einem Lac-Promotor und Lac-Operator kontrolliert wird
• Nach Einbringung des Plasmids wird durch Zugabe von IPTG der Lac-Operator freigegeben
• T7-Polymerase wird durch bakterielle RNA Polymerase transkribiert
• T7 RNA Polymerase bindet daraufhin den T7 Promotor am Plasmid (LacOperator durch IPTG Zuagbe nicht mehr gehemmt)
• Expression des Zielgens.

Durch das Anhängen von Tags an das Target-Protein über die DNA-Sequenz, kann das Protein spezifisch gereinigt werden

Ein Protein-Tag ist eine AS-Sequenz die an das Zielprotein C- oder N-terminak fusioniert wird.

Ein Tag kann die Stabilität, die Löslichkeit, die Funktionalität und die Expression des Proteins beeinflussen. Die Stärke hängt vom Tag und ob N- oder C-terminal fusioniert wird ab.

Die DNA-Sequenz muss „in frame“ also im Leserater im Plasmid sein.

N-terminal: zwischen Start-Codon und Proteinsequenz
C-Terminal: zwischen Protein-Sequenz und Stop-Codon

• His-Tag (6 aufeinanderfolgende Histidine, häufig verwendet)
• Strep-Tag (8 AS, hohe Afifinität gegenüber Streptavidin
• GST-Tag
• Intein-Tag

Die Auswahl des Tags bestimmt welche Aufreinigungs-Methode gewählt wird.

Proteine verteilen sich zwischen einer stationären und einer mobilen Phase und können dadurch getrennt werden.

Das Proteingemisch wird über eine Matrix geleitet auf der sich Liganden, die spezifisch für das Target Protein sind befinden. Getaggte Proteine binden an den Liganden und bleiben an der Matrix. Danach können sie ausgewaschen werden.

Liganden sind z.B: AK oder Enzymsubstrate, ausgewaschen wird z.B. mit konzentrierter Kösung des Enzymsubstrats oder Salzsäuren, oder Lösungen mit niedrigem/hohem pH Wert

Sehr selektiv, bis zu 1000-10000 Proteine pro Durchgang

Zur Reinigung von Proteinen mit His-Tags.

NTA (Nitrilitriessigsäure) ist an der Oberfläche einer inerten Matrix gebunden.

• Komplexbildner
• 4 Chelationsstellen für Nickelionen
• Sehr hohe Bindungskapazität

Nickel koordiniert mit den Stickstoffatomen von His-Tags --> Getaggte Proteine binden, der Rest wird ausgewaschen.

• Zellen lysieren
• Bindung der His-Tag Proteine an Ni-NTA
• Auswaschen der ungebundenen Proteine
• Eluieren der getaggted Proteine mit Imidiazol (löst Bindung zwischen His-Tag und Ni-NTA)

• Ionenaustausch-Chromatographie
• Dünnschicht-Chromatographie
• HPLC