Proteine II Methoden
Proteine II Methoden
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Flashcards
Warum ist die Struktur-Aufklärung von Proteinen wichtig?
"Proteine II Methoden"
1. Struktur bedingt Funtion
2. Verständnis von physiologischen oder pathologischen Vorgängen
3. Therapie-Maßnahmen setzen detaillierten Struktur/Funktions-Erkenntnisse voraus (Genreparatur)
4. biochemische Qualitätskontrolle theraupeutisch eingesetzter Proteine (z.B. Antokörper, Hormone)
Kenntnis wichtiger proteinbiochemischer Methodn ist essentiell zum Verständnis und der Bewertung von:
"Proteine II Methoden"
1. Fehlfunktionen (z.B. Hormone)
2. Krankheitsdiagnostik (z.B. Tumormarker)
3. Matrix-Stabilität (z.B. von Blutproben; Erythrozyten platzen wenn Kanüle zu eng ist)
4. Vergiftungsanalyse (z.B. Leberenzymwerte)
5. Immunstatus (z.B. IgG-Gehalt; Nach Impfung, bei Neugeborenen)
6. Reproduktionsstatus (z.B. Zyklusnachweis; LH und FSH)
Reinigung von Proteinen:
"Proteine II Methoden"
1. Konzentration (Fällung-Precipitacao, Zentrifugation)
2. Chromatographie
3. Elektrophorese (SDS-Page, IEF, 2D)
Nachweis von Proteinen:
"Proteine II Methoden"
1. Anfärbung
2. Bio-Assays
3. Immundetektion (RIA, ELISA, Westernblot, Immunhistologie-HCG Nachweis Schwangerschaft)
Charakterisierung von Proteinen:
"Proteine II Methoden"
1. Sequenzierung (AS-Abbau, MS)
2. Raumstruktur (Röntgen-Kristallographie)
3. Modifikationen (Glykosylierung, Methylierung, Acetylierung)
Wie läuft Proteinreinigung ab?
"Proteine II Methoden"
1. Gewebe mit hohem Gehalt aussuchen: Extrazelluläre, Cytoplasmatische, Membrangebundene, Organellenspezifische und "unlösliche" Proteine
2. Chemischre Vorinformationen: Große, Ladung
3. Nachweis-System: Funktionstest
4. Organgewinnung: schnell, kühl, O2-frei
5. Homogenisation (physikalisch/chemisch): Separierung von Zelltypen (Vereinzeln, Trennung), Aufschluss der Zellen (entfällt bei Körperflüssigkeiten), Separierung der Zellkomponente (Trennung der Organellen)
6. Stabilisierung des Proteins im Extrakt (Puffer)
7. Reinigung mittels biochemischer Verfahren
8. Reinheits- und Funktionskontrolle
9. Strukturbestimmung
WElches Prinzip hat Fällung/Aussalzen von Proteinen? (Reinigungsmethode)
"Proteine II Methoden"
Ausnutzen des spezifischen Löslichkeitsverhalten unter Einfluss von:
1. Hochsalz
2. pH
3. Temperatur
4. Lösungsmittel
Welche Anwendung hat Zentrifugation? Welche Arten davon gibt es?
"Proteine II Methoden"
Fraktionierte und Differenzielle Zentrifugation
Anwendung: Trennung von:
1. Zellen aus Gemischen
2. Zellbestandteilen
3. Präzipitaten
Welches Prinzip hat die Dichte-Zentrifugation? Wie läuft sie ab?
"Proteine II Methoden"
Ausnutzen der spezifischen Dichte im Dichtegradiente
1. Dichtgradient (z.B. Zuckerlösung)
2. Zentrifugation
3. Fraktionsammlung
Welches Prinzip hat Dialyse (Entsalzen)?
"Proteine II Methoden"
Diffusion kleiner Moleküle durch semipermeable Membran unterschiedlicher Porengrößen -> Rückhaltung großer Moleküle
Welches ist das Grund-Prinzip der Chromatographie-Verfahren?
"Proteine II Methoden"
Nutzung der Laufunterschiede aufzutrennender Substanzen zwischen fester Phase (Säulen, Platten, Kapillaren) und flüssiger Phase (Pufer) -> Gelfiltration, Ionentausch und Affinität
Welches Prinzip hat Gelfiltrations-Chromatoraphie?
"Proteine II Methoden"
Große Moleküle laufen an porösem Gelmaterial vorbei (->scnheller), kleine dringen in die Gel-Poren ein (->langsamer), d.h. längere Laufzeit.
Welches Prinzip hat Ionenaustausch - Chromatographie?
"Proteine II Methoden"
Wechselwirkung zwischen geladenen Molekülen (Ionen) führt zur Bindung an Säule (geladenes Material)
Welches Prinzip hat Affinitäts - Chromatographie?
"Proteine II Methoden"
Ausnutzen spezifischer Wechselwirkungen zur selektiven Bindung/Elution gewünschter Substanzen. Z.B. Antikörper/Antigen ->Vorteil: Hohe Anreicherung in einem Schritt.
Was ist das Grund-Prinzip von Elektrophorese-Verfahren?
"Proteine II Methoden"
Trennung geladener Proteine im elektrischen Feld in einer Gelmatrix, z.B. Acrylamid, Agarose.
Welches Prinzip hat Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)?
"Proteine II Methoden"
Alle Proteine werden durch SDS negativ geladen und im elektrischen Feld in einem Gel mit definierter Porengröße getrennt -> Sichtbarmachen durch Protein Farbstoffe.
Welches Prinzip hat die Isoelektrische Fokussierung (IEF)?
"Proteine II Methoden"
Protein wandert im elektrischen Feld aufgrund seiner Ladung entlang eines pH-Gradienten solange, bis es neutral geladen ist -> Isoelektrischer Punkt
Was ist die 2D-Elektrophorese? Wie funktioneiert diese Reinigungsmethode?
"Proteine II Methoden"
Kombination zweier Trennverfahren:
1. Isoelektrische Fokussierung (1. Dimension)
2. SDS-Elektrophorese (2. Dimension)
Prinzip: Proteine werden gemäß ihrem pI getrennt (1D), dann nach Größe (2D) -> Wichtigstes Proteom-Analyseverfahren!
Was bedeutet Sequenzierung (Charakterisierungsmethode von Proteinen)?
"Proteine II Methoden"
Aminosären-Analysator: Bestimmung des Gesamt-AS-Gehalt, nicht der Sequenz!
Prinzip: Quantifizierung des genauen AS-Gehalts eines Proteins nach:
1. Hydrolyse
2. Chromatographie
3. Detektion einzelner AS
-> Massenspektrometrie (MS): Analyse der "Flugzeit" von Peptiden im Vakuum -> nur kleine Peptide (<15000Da) nachweisbar.
Welches Prinzip hat die Röntgen-Struktur-Analyse? (Raumstruktur)
"Proteine II Methoden"
Nach Kristallisation des Proteins erfolgt aufgrund der Röntgenbeugung der Proteinkristalle die Berechnung der Raumstruktur
Welche Analysenverfahren sind nötig um die Aufklärung von Modifikationen wie Phosphorylierung, Hydroxylierung, u.a., zu verlangen?
"Proteine II Methoden"
1. Trennung der Proteine aus komplexen Gemischen durch z.B. 2D-Elektrophorese
2. Protein-Fragmentierung in Peptide (Protease) und nachfolgende MS-Analyse
3. Datenbankabgleich (Peptid-Bibliotheken) und evtl. Funktionszuweisung (bekannte Domänen)
Welches Prinzip haben Bio- und Immun-Assays?
"Proteine II Methoden"
1. Bio-Assays (Funktionstests für Proteine): Die biologische Aktivität des Proteins erlaubt Aussagen über dessen Funktion und Menge (Enzym, Hormon)
Bei Enzymen erfolgt Funktionstest durch Nachweis der katalytischen Eigenschaft. Z.B. Succinat-Dehydrogenase mittles gekoppelter Redox-Reaktion. TCC -> Formazan (rot) statt Hydrochinon -> Ubichinon
Insulin: Systemische Wirkung von Insulin erlaubt Aussagen zur Menge + Aktivität
2. Immun-Assays (Antikörper-basierte Testsysteme): Selektive Antikörper erkennen ein spezifisches Protein als Antigen. Quantifizierung und Lokalisierung definierter Proteine möglich. Gekoppelte Sekundärsysteme als Nachweisprinzip (Colorimetrie, Fluorimetrie)
Welche Klassen von Antikörpern gibt es? Wodurch ist ihre Eigenschaft beschreibbar?
"Proteine II Methoden"
1. IgG: spezifisches Serum-Ig (Bakterien, Viren)
2. IgE: anti-Parasiten-Ig
3. IgM: Erste Immunantwort
4. IgA: Sekret-Ig
5. IgD: Funktion? (B-Zell-Aktivierung?)
Die Antikörper-Eigenschaft ist beschreibbar durch ihre Spezifität (AG-Erkennung), Affinität (Assoziationskonstante AK/AG 10-12 - 10-15 L/mol) und Aktivität (Assoziation mit verschieden AG-Bindungsstellen)
Produktin spezifischer Antikörper-pAK. Generierung polyklonaler Antikörper gegen ein gereinigtes Protein:
"Proteine II Methoden"
Immunisierung, Serumgewinnung. Auch Generierung monoklonaler Antikörper gegen ein gereinigtes Protein (Vorteil: Hochspezifishe Antikörper-Klone als Zellkultur "ewig" produzierend und "unsterblich".
Was bedeutet RIA und ELISA? Welches Prinzip hat diese Nachweismethodefür Proteine?
"Proteine II Methoden"
RIA: Radio-Immuno-Assay, Isotope-Markierung
ELISA: Enzyme-linked-immuno-sorbent-assay, Enzym-Markierung
Exakte Quantifizierung von Proteinen mittels Antikörpern
Prinzip: Markierte Antikörper erkenne spezifisch ihr Antigen -> ideale Quantifizierungs-Möglichkeit für Proteine.
Welches Prinzip hat Westernblot - Immundetektion?
"Proteine II Methoden"
Größen- und Identitäts-Bestimmung nach SDS-PAGE mittes markierter Antikörper (Isotope oder Enzyme) -> Methode zur Protein-Qualitätsbestimmung
Welches Prinzip hat Westernblot - Immundetektion?
"Proteine II Methoden"
Größen- und Identitäts-Bestimmung nach SDS-PAGE mittes markierter Antikörper (Isotope oder Enzyme) -> Methode zur Protein-Qualitätsbestimmung
Welches Prinzip hat Immunhistochemie - Immundetektion?
"Proteine II Methoden"
Lokalisierung von Proteinen mittles markierter Antikörper in histologische Schnitten.
Praktische Beispiele für Protein-Analytik in der medizinischen Diagnostik:
"Proteine II Methoden"
1. Erfassung allg. Konzentrationsverschiebungen von Serumproteinen ("Blutsenkung", Hämatokrit, Hb-Wert) ->Schwerkraft (Zentrifugation), Elektrophorese, EIA
2. Qualitäts- und Quantitätsverschiebung spezifischer Proteine (z.B. Serum IgGs) -> Chromatographie, Elektrophorese, EIA
3. Neuauftreten von Proteinen (Harn, Tumormarker) -> Elektrophorese, ELISA
4. Akutphaseproteine (CRP-> C-reaktives Protien) -> ELISA
Was ist ein Zwitterion?
"Proteine II Methoden"
Ein Zwitterion ist ein Molekül mit zwei oder mehreren funktionellen Gruppen, von dene eine positiv und eine andere negativ geladen ist. Z.B. AS
Was sind "Biogene Amine"
"Proteine II Methoden"
Biogene Amine sind primäre Amine, die im Stoffwechsel durch enzymatische Decarboxylierung von Aminosäuren entstehen.-> sind wichtige Signalstoffe
Welche sind die vier Strukturhierarchien und fünf Bindungstypen, die Peptidbindungen zusammensetzen?
"Proteine II Methoden"
1. Primär: Ohne 3D-Raumstruktur
2. Sekundär: H-Brücken zwischen Peptidbindunge, Helix +Flatblatt
3. Tertiär: H-Brücken + v. d. Vaals + hydroph. + Ionen + Disulfid-Bbg. zwischen den Seitenketten, Domänen
4. Quartär: Mehrere Peptidketten, die meist über Disulfid-Brücken verbunden sind, mind. Dimere.
Wichtige Proteine mit besonderen Funktionen:
"Proteine II Methoden"
Keratin: alpha-Helix, Haare, Nägel
Seidenprotein (Fibroin): beta-Faltblatt
Kollagen: besondere Tripel-Helix, Bindegewebe, Basallamina, enthält Hydroxyprolin (Vit. C-Funktion!)
Hämoglobin: Quartärstruktur (Tetramer), spezielle kooperative Funktion durch diese Struktur -> Allosterie-Effekt
