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Primer & Hybridisierung

Methoden

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Theresa Weiss
Study
Theresa Weiss
Diese Lernkarten behandeln fortgeschrittene Konzepte der Biologie auf Universitätsniveau, mit Fokus auf Primer und Hybridisierung. Sie decken Themen wie die Designprinzipien von Oligonukleotiden, die Berechnung der Schmelztemperatur (Tm), und die Bedeutung von Sequenzkomplementarität ab. Die Karteikarten sind besonders nützlich für Studierende und Forscher, die sich mit molekularbiologischen Techniken wie PCR und RNA-Interferenz beschäftigen, da sie detaillierte Einblicke in die Optimierung von Primern und die Vermeidung von Sekundärstrukturen bieten.
Flashcards
10
Students
2
Language
German
Category
Biology
Level
University
Created / Updated
24.06.2016 / 03.07.2016
  • 1  / 10

Flashcards

Was sind Oligonukleotide und wofür werden sie verwendet?

kurze, synthetisierte, einzelsträngige DNA/RNA-Stücke; meist 15-20 Nt

  • Primer
  • Sonden

Was muss man beim Design von Oligos beachten?

  • Tm = meltind temperature = Temp. bei der ein Hybrid zu 50 % denaturiert ist
  • Länge
  • Qualität der Sequenz
  • G-C-Anteil
  • 3'Ende
  • potentielle Sekundär-Strukturen

Was bestimmt die Leistung eines Primers?

Qualität & Sepzifität der Sequenz

  • keine Sequenzen mit niedriger Komplexität (tandem-repeats, ect.)
  • keine Bereiche die an homologe Sequenzen binden können

ideal:

  • Primer hybridisiert nur mit gewünschter Sequenz
  • muss an einzigartigen Stellen positioniert werden (Exon/Intron-Grenzen, Kodierenden Stellen)

Welche Länge soll ein Primer haben?

Mindestens 17 Nt --> Wahrscheinlcihkeit einer 2. Sequenz im Genom gleich 0

Aber je kürzer ein Primer, desto besser kann er binden

18-25Nt

Wie wird die Tm bestimmt?

Bei der Tm sind 50% der Primer an Template gebunden

sie ist abhängig von der Länge und dem GC zu AT-Verhältnis (GC erhöht Tm)

soll zwische 54° und 80° und 5° über der annealing Temperature liegen

Unterschied zwischen den beiden Primern: max 2°

Wie kann man die Tm berechnen?

Tm = 2x(A+T)+4x(C+G)

Was sollte bei der Sequenz des Primers beachtet werden?

  • GC-Anteil
  • keine Palindromsequenzen
  • keine Komplementaritäten (Sekundärstrukturen)
  • 3' Ende von forward und reverse primer nicht komplementär

Wie erflogt die Denaturierung?

durch die negativen Phsophatgruppen und die Entropiierhöhung

ist ein kopperativer Vorgang, AT beginnt Blasen zu bilden = geschwindigkeitsbestimmender Schritt

danach in beide Richtungen kooperativ getrennt

verstärkt: organische Lm, hoher pH Wert
verhindert: hohe Inonenkonz (schirmt Ladungen ab), WBB

Wie erfolgt die Hybridisierung?

Nucleation = Anlagern von 3-6 Basen = geschw. bestimmender Schritt

der Rest hybridisiert rasch

Was sind therapeutische Oligos?

lagern sich an ssRNA oder dsDNA oder Proteine

binden z.B: Promotoren oder TF --> inhibieren der Transkription

siRNA an mRNA -->Spaltung

nicht-antisense-spezifische Nebeneffekte (Oligos mit CpG Dinukleotiden)
--> Stimulation von B-Lymphozyten (B-Zell-Leukämie)

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