Pflanzenzüchtung Teil 4

• Klasse 1: Retrotransposons

Diese Transposons vervielfältigen sich über ein RNA-Intermediat, das heißt ihre Sequenz wird transkribiert, die entstehende mRNA wird revers transkribiert und diese Kopie an einer anderen Stelle im Genom eingefügt. Retrotransposons vermehren sich nach einem Copy & Paste Mechanismus.

• Klasse 2: DNA-Transposons

Diese Transposons werden mit Hilfe der Transposase aus der DNA ausgeschnitten und an einer anderen Stelle im Genom wieder eingefügt. Es wird keine zusätzliche Kopie des Transposons dabei erstellt. Es springt nach einem Cut & Paste Mechanismus. 

Springt das Transposon in eine Sequenz außerhalb eines Gens bzw. seiner

Regulationssequenz, so hat es keinen Effekt auf den Phänotyp. Wird das Transposon in die Sequenz eines Gens inseriert, so ist das daraus entstehende Proteinprodukt funktionsunfähig und es wurde eine Knock-out Mutante erzeugt. Sollte das Transposon in die regulatorische Region eines Gens springen, so kann es die Transkripition dieses Gens beeinflussen, zum Beispiel indem es Promotoren abschaltet oder die Transkription in Zellen veranlasst, wo diese normalerweise unterdrückt ist. Dies kann unter anderem zur gefleckten Färbung von Maiskörnern führen: ist ein Transposon in dem Pigmentgen, so bleibt das Korn farblos bis gelblich, ist es nicht vorhanden wird das Pigmentgen korrekt exprimiert und die Körner haben eine braune Farbe.  

Die flankierenden Sequenzen der eingefügten bekannten Sequenzen (wie Transposons oder T-DNA) kann ermittelt werden, indem zuerst das Genom mit Restriktionsenzymen verdaut wird, die nicht innerhalb der eingefügten Sequenz schneiden. Die verdaute DNA wird dann mit sich selbst ligiert, sodass zirkuläre Teilstücke entstehen, die an den Restriktionsüberhängen zusammengefügt sind. Somit kann in einer reversen PCR mit Hilfe von Primern die komplementär zu der bekannten Insertionssequenz sind amplifiziert werden, weil durch die Zirkularisation diese Primer eine Amplifikation der flankierenden Sequenzen in beide Richtungen möglich ist, ohne dass man noch eine weitere Sequenz up- oder downstream der eingefügten Sequenz für einen weiteren Primer kennt. Die so amplifizierte Sequenz kann dann sequenziert werden, die jeweiligen Enden der flankierenden Sequenzen sind an der Sequenz der Restriktionsschnittstelle erkennbar, an der der DNA-Ring geschlossen wurde. 

• Bei dem Knock-out mancher Gene ist kein entsprechender Phänotyp zu beobachten, zum Beispiel weil das Gen dupliziert an einer anderen Stelle im Genom noch mal vorliegt und damit den Knock-out kompensieren kann. Auch die Existenz alternativer Stoffwechselwege oder regulatorischer Netzwerke kann die Ausprägung eines Phänotyps verhindern, indem das fehlende Gen kompensiert wird. Weiterhin kann das Gen, das ausgeknockt wurde, auch essentiell sein, sodass ein Knock-out zu einem letalen Phänotyp führt, der natürlich somit auch nicht beobachtet werden kann, weil die Pflanze aufgrund der Mutation stirbt.
• Alternative Ansätze zur Erzeugung von Knock-out Mutanten sind zum Beispiel das Activation Tagging, was anstatt des Verlusts einer Funktion den Gewinn einer Funktion verursacht. Eine weitere Methode ist Promotor bzw. Enhancer Trapping, das durch blockieren von Promotoren oder Enhancern die Expression eines Gens vermindern. 

Das Ziel der reversen Genetik ist es, bereits bekannten Genen eine Funktion zuordnen. Dies wird möglich durch die Sequenzierung diverser Genome, sodass viele Gene ohne bekannte biologische Funktion identifiziert werden konnten. Von diesen Genen soll durch die reverse Genetik in der post-Sequencing Era die Funktion ermittelt werden. Die Voraussetzung dafür ist, dass die Genomsequenz vollständig oder zumindest teilweise bekannt ist. Hierfür sind zum Beispiel Sequenzentwürfe oder ESTSequenzen verwendbar.  

• Die genomweite Mutagenese kann erfolgen durch
  • insertionelle Mutagenese,
  • Schnelle Neutronen-Mutagenese oder
  • TILLING.

Insertionelle Mutagenese: Diese Methode greift zurück auf T-DNA-Insertionen oder transposable Elemente (wie zum Beispiel Ac/Ds, En/Spm oder Tos17). Es lassen sich Knock-out Mutanten erzeugen, durch Promotor- oder Enhancer-Trapping die

Expression eines Gens vermindern oder durch Activation Tagging eine vermehrte Expression erreichen.  Hierfür wird eine Insertionslibrary erstellt, indem ein Fragment bekannter Sequenz (z.B. T-DNA oder ein Transposon) in eine große Menge Pflanzensamen eingebracht wird. Es werden Proben der ausgewachsenen Pflanzen genommen und entweder zu 2D oder 3D DNA-Pools zusammengefasst. Der Nachweis der Insertion in das gewünschte Gen wird durch PCR nachgewiesen. Dafür werden Primer dazugegeben, die von den Enden der Gensequenzen nach innen zeigen und welche, die von der bekannten Insertionssequenz nach außen zeigen. Wenn das zu untersuchende Gen keine Insertion trägt, entsteht ein langes Fragment bei der PCR, ist das Insert jedoch enthalten dann entstehen zwei kurze Fragmente. Mit dieser Methode werden die DNA-Pools gescreent.  Die Individuen in einem positiven Subpool werden dann untersucht und solche Pflanzen ausgewählt und identifiziert. Aus diesen Pflanzen wird dann durch Selbstung eine Mutantenlinie erzeugt, deren Phänotyp charakterisiert werden kann.  

Schnelle Neutronen-Mutagenese:

Hierbei wird durch die Behandlung von Samen mit schnellen Neutronen eine Deletion erzeugt. Die M1-Population wird angebaut und die Samen der M2-Population der individuellen Pflanzen eingesammelt und angebaut. Es wird DNA aus den Individuen der M2-Population extrahiert und 2D oder 3D DNA-Pools erzeugt. Die Pools werden mittels genspezifischen Primern untersucht. Beim Wildtyp ist das Gen noch vollständig vorhanden, bei Deletionsmutanten fehlt ein Stück des Gens. Damit ist das PCR-Produkt der Mutante auch kürzer als das des Wildtyps. Somit kann eine Mutantenlinie identifiziert werden. 

Chemische Mutagenese/TILLING: 

Hierbei wird Guanin durch Ethylmethansolfunat (=EMS) alkyliert. Nach einer Replikation wird das komplementäre Cytosin durch Thymin ausgetauscht. Bei einer weiteren Replikation wird dann das alkylierte Guanin durch Adenin ausgetauscht. Somit wurde aus dem G/C-Basenpaar ein A/T-Paar.  TILLING bedeutet dabei

Targeting Induced Local Lesions In Genomes. Hierbei wird aus der nicht-chimären M2-Population die aus der chimären, mit Mutagenen behandelten M1-Population durch Selbstung erzeugt wurde,  DNA wird isoliert und gepoolt, die Gene von Interesse per PCR amplifiziert. Der Doppelstrang wird denaturiert und Duplexkomplexe erzeugt, wobei  jeder der beiden Stränge des Komplexes an gegenüberliegenden Enden markiert ist. Wenn sich aufgrund einer Mutation ein Heteroduplex bildet, wird dieser von CelI gespalten  und es entstehen Fragmente unterschiedlicher Länge als bei einem Homoduplex, der nicht gespalten wird, bestehen bleibt. Die Heteroduplexe werden dann von den Homoduplexen durch Gelelektrophorese unterschieden. Die Mutanten werden dann identifiziert und das PCR-Produkt der Mutanten sequenziert.  

Die Insertion der T-DNA ist abhängig von den verwendeten Gewebekulturtechniken. Es ist zum Beispiel denkbar, dass die Insertion der T-DNA nicht in allen Arten funktioniert. Außerdem kann diese Art der Insertion auch zusätzliche, unvorhergesehene Mutationen hervorrufen.  

Der Beschuss von Zellen mit schnellen Neutronen werden Teile des Genoms deletiert. Je nach Intensität und Dosis der Bestrahlung werden größere oder kleinere Fragmente deletiert. Die meisten Deletionen haben eine Länge von 2 bis 6 kb. Der Vorteil dieser Methode sind, dass sie nicht transgen ist, das heißt dass sie bei der Genehmigung des so gewonnenen Saatguts zur Verwendung für den Anbau nicht den speziellen Regeln für transgene Pflanzen unterworfen ist, was die Zulassung wesentlich einfacher macht. Außerdem werden durch diese Methode hauptsächlich Deletionen erzeugt, die auch ganze Genblöcke (= tandemly repeated genes) entfernen kann. 

TILLING bedeutet Targeting Induced Local Lesions In Genomes. Dabei wird zuerst das Saatgut mit chemischen Mutagenen (z.B. EMS) behandelt, um Mutationen zu erzeugen. Dabei wird unter anderem die optimale EMS-Konzentration bestimmt, sodass ein optimales Verhältnis zwischen Überlebensrate der Pflanzen und hoher Mutationsdichte erreicht wird. Die M1-Generation wird angebaut, geselbstet und anschließend die M2-Generation wieder ausgesät. Aus der Selbstung von M2 entstehen M3-Samen, die eingelagert werden. Die M2-DNA wird verwendet um Mutanten zu identifizieren, was über den Verdau von Heteroduplexen erfolgt. Die M3Samen werden ausgesät und der Phänotyp der identifizierten Mutanten darunter wird untersucht.

Bei der Untersuchung der M2-DNA wird folgendermaßen vorgegangen: zuerst wird die DNA verschiedener Individuen gepoolt. Es wird ein Modell für die Zielsequenz des zu untersuchenden Gens erstellt sowie die Primer designed. Die Zielregion wird mittels PCR amplifiziert. Anschließend werden die entstehenden Fragmente denaturiert und ein Annealing durchgeführt. Dabei entstehen Heteroduplexe, wenn Mutationen in der Zielsequenz aufgetreten sind. Die PCR-Fragmente werden mit CelI behandelt, das Heteroduplexe selektiv spaltet. Die Heteroduplexe werden dann mittels DHPLC oder Gelelektrophorese nachgewiesen. Durch die Spaltung der Heteroduplexe entstehen zwei Fragmente, die sich in der Länge voneinander und von dem nicht gespalteten Homoduplex unterscheiden. Damit können Mutanten identifiziert werden und das PCR-Produkt der Mutante kann sequenziert werden.  

Die Vorteile beim TILLING sind, dass es sich auch hier um ein nicht-transgenes Verfahren handelt. Es werden also keine Transgene in die Pflanzen eingebracht, wodurch die Regulationen für deren Anbau wesentlich weniger streng sind. Zudem können neue allelische Variation erzeugt werden, wodurch die Untersuchung von allelischen Serien mit Missense- oder Knock-out Mutationen ermöglicht wird. Es handelt sich um eine Hochdurchsatzmethode

Die Gene müssen nicht von Anfang an ausgeschaltet sein, sodass auch das Silencing von Genen in ausgewachsenen Pflanzen möglich wird, die bei einem Knock-out zu einem lethalen Phänotyp führen würden

Zum einen können mit dieser Methode auch Gene identifiziert werden, die normalerweise lethal wirken bei Mutation, weil sie auf ausgewachsene Pflanzen anwendbar ist und die Unterdrückung der Genexpression nicht vollständig ist. Außerdem kann damit auch funktionelle Redundanz und vollständig oder teilweise

Homologe unterdrückt werden (bis zu 80-90% Homologie). Damit können Multigenfamilien gezielt untersucht werden, ohne dass die funktionelle Redundanz verhindert, dass die Knock-out Mutation keinen Phänotyp hervorruft. Dies ist vor allem bei polyploiden Spezies sehr nützlich, wo mehrere homologe Kopien eines Gens mit einem einzigen RNAi-Konstrukt gesilenced werden. 

Genfamilien oder Genduplikationen können zu Problemen führen, weil dann das Targeting mit genspezifischen Primern oder Sonden mehrere Ergebnisse liefert.

Außerdem kann diese Redundanz dazu führen, dass trotz einer Mutation keine Änderung des Phänotyps auftritt. Je nachdem welche Technik genutzt wird, können auch multiple unerwünschte Mutationen in derselben Pflanze auftreten. Ein weiteres Problem kann die Erhaltung der Mutantensamen sein, vor allem was Lagerung und Lebendanteil betrifft. Die Genfunktion muss immer noch durch einen Komplementationstest bestätigt werden (Komplementierung mit dem Wildtyp-Allel) und die Aufspaltung der Mutation in den Nachkommen muss untersucht werden.