Pflanzenzüchtung Teil 2

• Analyse der Qualität des Einzellocus-Modells mit dem Goodness of Fit Test: Untersuchung der Markerqualität für einen einzelnen Locus um zu sehen, ob er wie erwartet vererbt wird
• Analyse von Modellen mit zwei Loci zur Detektion der Kopplung und Abschätzung des Anteil mit Rekombination: Genetische Kopplung bedeutet, dass Gene auf einem Chromosom gekoppelt vererbt werden. Diese Kopplung kann durch Crossing Over, das zwischen den Genen stattfindet, aufgehoben werden. Um festzustellen, ob eine Kopplung vorliegt oder die Marker unabhängig voneinander vererbt werden, wird wieder der Chi-Quadrat-Test angewendet. 
• Anordnen der gekoppelten Marker in Gruppen: Die Loci werde in Kopplungsgruppen aufgeteilt, wobei in einer Gruppe all die Loci zusammengefasst werden, die eine Kopplung miteinander aufweisen. Diese Marker liegen zusammen auf einem Chromosom. Die Gruppen können durch statistische Kriterien (z.B. Rekombinationsfrequenz zwischen den Markern) oder biologischen Kriterien (z.B. Anzahl der Chromosomen) zusammengestellt werden. 
• Der Reihe nach Anordnen der gekoppelten Marker: Die lineare Anordnung der Loci beruht auf deren genetischen Abstand, der aufgrund der Rekombinationsfrequenz berechnet werden kann. Meist werden dabei auch doppelte Crossing Overs und die Interferenz beachtet, welche doppelte Crossing Over an manchen Positionen verhindert. Die Anordnung der Loci beruht zum Beispiel auf dem Prinzip der größten Wahrscheinlichkeit oder sucht nach der geringsten Chromosomenlänge und der geringsten Anzahl von Crossing Overs. 
• Multi-Point Analyse 

Die Kartendistanzen werden gemessen in centiMorgan. Sie wurden eingeführt, weil die Rekombinationsfrequenzen sich nicht additiv verhalten, da doppelte Crossing Overs umso wahrscheinlicher werden, je weiter zwei Loci auseinander liegen, und dadurch trotz der Rekombination für diese beiden Loci die parentale Kombination vorliegt.  

Der Goodness of Fit Test untersucht, ob sich das beobachtete Aufspaltungsverhältnis signifikant von dem erwarteten Verhältnis unterschiedet, und damit ob sich ein Locus als Marker eignet, weil er entsprechend den Erwartungen vererbt wird. Er untersucht die Markerqualität für einen einzelnen Locus.

Genetische Distanzen sind abhängig von der Rekombinationswahrscheinlichkeit. Die Wahrscheinlichkeit eines Crossing Overs ist allerdings nicht überall auf dem Chromosom konstant: An den Enden finden Rekombinationen viel öfter statt als am Contromer. Da genetische Distanzen gemessen werden an der Häufigkeit, mit der eine Rekombination zwischen zwei Loci stattfindet, ist der genetische Abstand abhängig von der Crossing Over-Wahrscheinlichkeit. Die physikalischen Abstände geben den Abstand der Loci absolut in Basenpaaren an, unbeeinflusst von der Wahrscheinlichkeit, dass zwischen den Loci ein Crossing Over stattfindet. Die Wahrscheinlichkeit der Rekombination ist abhängig vom Geschlecht, dem Individuum (genetischen Faktoren), dem Chromosom sowie der Position auf dem Chromosom, der Temperatur und weitere Umweltfaktoren.  

Anfangs wird eine spaltende Kreuzung bezüglich dieses Zielgens durchgeführt. Dabei wird ein jeweils homozygoter Elter der das Zielgen in der gewünschten Ausführung besitzt mit einem homozygoten Elter gekreuzt, der es in einer anderen Ausführung besitzt. Die entstehende F1-Generation ist dann heterozygot für dieses Merkmal. Damit soll ein Marker gefunden werden, der mit dem Zielgen koppelt. 

Hierfür gibt es drei verschiedene Methoden: 

1. Erstellen einer Kopplungskarte des gesamten Genoms (hierfür wird eine große AnzahlMarker und eine Analyse der gesamten Population benötigt)
2. Entwicklung nah-isogener Linien durch wiederholte Rückkreuzung (sehr zeitaufwändig)
3. Bulked Segregant Analysis (relativ schnell, man muss nicht die ganze Population mit allen Markern untersuchen) 

• Nah-isogene Linien sind Linien, die sich auf ihrem ganzen Genom nur in der Umgebung eines einzelnen Zielgens unterschieden.
• Sie werden erzeugt aus einem Donor- und einem Rezipientenstamm. Der Donorstamm liefert dabei das Zielgen, der Rezipientenstamm denRest der DNA. Die beiden Stämme werden spaltend gekreuzt aus jeweils homozygoten Eltern. Die heterozygoten Nachkommen werden rückgekreuzt mit dem homozygotenRezipientenelter. Bei der Kreuzung findet Crossing Over statt, sodass ein Teil der DonorDNA durch Rezipienten-DNA ersetzt wird. Die nachfolgenden Generationen aus weiteren solchen Kreuzungen mit dem Rezipientenelter werden dann auf das gewünschte Zielgen selektiert und immer wieder rückgekreuzt. So entsteht mit der Zeit eine Linie, die das Zielgen des Donorstamms im restlichen Genom des Rezipientenstamms trägt. 
• Nah-isogene Linien können verwendet werden, um Marker in der Nähe des Zielgens zu identifizieren. Dabei werden Marker auf dem gesamten Genom untersucht. Da sich die Genome außer in der Umgebung des Zielgens jedoch nicht vom Rezipientenstamm unterscheiden, weisen nur solche Marker einen Polymorphismus auf, die zusammen mit dem Zielgen übertragen wurden und somit mit dem Zielgen eng koppeln. NILs werden auch erzeugt bei der Einführung eines Zielgens in einen anderen genetischen Hintergrund.  

In der Bulked Segregant Analysis werden wieder zwei homozygote Eltern gekreuzt. Die aufspaltende Nachkommenschaft wird eingeteilt in Gruppen (=Bulks), die durch die jeweiligen Phänotypen ausgezeichnet sind (z.B. resistent – anfällig). Anschließend wird sowohl die DNA der Eltern als auch die DNA der Bulks isoliert und die Marker verglichen. Durch das poolen der Genotypen in Bulks werden eine Art „künstliche NILs“ erzeugt. Diese unterscheiden sich auf Grund von Crossing Overs während der Fortpflanzung und sind somit im Durchschnitt heterozygot. Lediglich die Gruppe, die den rezessiven Phänotyp aufweist, ist an der Stelle des Zielgens homozygot rezessiv. Das Zielgen koppelt also mit solchen Markern, die in den Eltern und der rezessiven Variante jeweils homozygot vorliegen, in der Gruppe mit dem dominanten Phänotyp jedoch heterozygot sind. Trifft diese Aufteilung nicht zu, dann koppeln die Marker mit dem Zielgen nicht. 

Diese Methode bietet den Vorteil, dass dabei nur die Marker in allen Individuen der Population kartiert werden müssen, die mit dem Zielgen koppeln. 

Der verwendete Marker muss mit dem QTL (= quantitativ vererbtes Merkmal) eng koppeln, das heißt Crossing Overs dazwischen dürfen nicht/nur höchst selten auftreten. Der diagnostische Wert des Markers muss bestätigt sein für den jeweiligen genetischen Hintergrund, das heißt ob der Marker und der entsprechende QTL in der gegebenen Population wirklich verlässlich in der jeweiligen Kombination koppeln. (In einer Population zum Beispiel könnte der Marker m mit dem QTL q koppeln und M mit Q, in einer anderen koppelt m mit Q und M mit q.)

Die markergestützte Selektion wird nur eingesetzt, wenn sie kosteneffizienter, präziser oder weniger zeitaufwändig ist als die Selektion nach Phänotypen. 

Foreground Selection: benutzt Marker um ein Zielallel zu selektieren, dessen direkteSelektion über den Phänotyp schwer ist (z.B. rezessive Allele oder QTL Allele). DieseMarker werden auch dazu benutzt, ein Transgen in einen anderen genetischen Hintergrund (andere Pflanze, von einer Donorlinie zu einer Rezipientenlinie) zu transferieren. Dafür werden Donor- und Rezipientenstamm (jeweils homozygot) gekreuzt. Bei der Selbstung der F1-Generation entstehen auch Crossing Overs, sodass die entstehenden Nachkommen teilweise das Zielgen mit den flankierenden Markern auf Chromosomen haben, die Abschnitte von beiden Linien haben. Durch wiederholte Rückkreuzung sowie Selektion auf die flankierenden Marker entstehen Nachkommen, die das Zielgen tragen aber deren Genom gleichzeitig größtenteils dem der Rezipientenlinie entspricht. Durch Selbstung oder der Erzeugung von Doppelt Haploiden eines solchen Nachkommen gelangt man zu homozygoten Trägern des Zielgens. 

Background Selection: benutzt Marker um den Anteil des Donorgenoms zu minimieren. Dadurch wird der Linkage Drag (= mitziehen von Genen die benachbart zum Zielgen sind) sowie die nötige Populationsgröße reduziert. Außerdem soll vor allem der Anteil des Donorgenoms an den Non-Carrier-Chromosomen (die nicht das Zielgen tragen) minimiert werden, was gleichzeitig eine kleinere Populationsgröße und eine geringere Anzahl an zu untersuchenden Markern zulässt. Die verwendeten Marker werden dafür genutzt, auf einen möglichst großen Anteil von Rezipientengenom zu selektieren. Alternativ ist gleichzeitig eine wiederholte Rückkreuzung mit einer Selektion auf die ForegroundMarker möglich, sodass das eingeführte Gen nicht verloren geht.

Die Background Selection kann in zwei, drei oder vier Schritten erfolgen: Zweischritt-Verfahren: zuerst wird auf das Vorhandensein des Zielallels selektiert, anschließend auf ein Individuum das für eine möglichst große Anzahl von Rezipientenmarkern homozygot ist.

Dreischritt-Verfahren: Zuerst wird auf das Vorhandensein des Zielallels selektiert, dann werden Individuen gesucht, die homozygot für die Rezipientenallele sind, die das Zielgen flankieren und anschließend wird daraus ein Individuum gewählt, das für eine möglichst große Anzahl von Rezipientenmarkern homozygot ist.

Vierschritt-Verfahren: Zuerst wird auf das Vorhandensein des Zielallels selektiert, dann werden Individuen gesucht, die homozygot für die Rezipientenallele sind, die das Zielgen flankieren. Anschließend wird darauf selektiert, dass alle Marker auf dem CarrierChromosom homozygot das Rezipientenallel tragen und anschließend wird daraus ein Individuum gewählt, das für eine möglichst große Anzahl von Rezipientenmarkern auf allen Chromosomen homozygot ist. 

Eine höhere Anzahl an Schritten reduziert die Anzahl der Rückkreuzungsgenerationen und damit auch die anfallende Datenmenge in jedem einzelnen Schritt.  

Die Marker müssen mit dem jeweiligen Zielgen eng koppeln und einen Polymorphismus zwischen Rezipienten und Donor aufweisen.  

Die verwendeten Marker sind die Background-Marker, die also auf dem gesamten Genom in etwa gleichmäßig verteilt sind. Dies ist wichtig, um herauszufinden, welchen Anteil das Donorgenom abgesehen vom Zielgen am Gesamtkonstrukt hat. Somit kann mit den Markern des Rezipientengenoms auf einen maximalen Anteil dessen selektiert werden. Die Marker müssen einen Polymorphismus zwischen Donor und Rezipient aufweisen.