Pflanzenbio Teil 8
Protein-protein Interaktionen und Network-Analysis
Protein-protein Interaktionen und Network-Analysis
8
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L. H.
L. H.
Diese Lernkarten decken fortgeschrittene Techniken zur Identifikation und Analyse von Protein-Interaktionen auf Universitätsniveau ab. Sie behandeln Methoden wie Yeast-2-Hybrid (Y2H), Affinitäts-Purifikation und Massenspektrometrie, sowie die Verwendung von ORFs und Reportergenen. Die Karteikarten sind besonders nützlich für Studierende und Forscher in der Biologie, die sich mit funktioneller Genomik und Proteomik beschäftigen, da sie detaillierte Einblicke in experimentelle Ansätze und deren Anwendungen bieten.
Karten
8
Lernende
1
Sprache
Deutsch
Kategorie
Biologie
Stufe
Universität
Erstellt / Aktualisiert
23.01.2015 / 28.01.2015
Protein-Protein-INteraktions-Assay
Tastatur-Befehle:
= drehen,
= vor-/rückwärts,
= scrollen
- Binäre Interaktionsidentifikation
- Yeast-2-Hyprid (Y2H)
- Split Ubiquitin (Split-Ubq)
- Protein Arrays
- Protein complex identification
- Affinity purification (AP)- mass spectromatry (MS)
- Immunoprecipitation (IP) (with MS or Western Blot)
- Luciferase-based mammalian interactome (LUMIER)
- in vivo visualization
- Bimolecular fluorescence complementation (BiFC)
- Fluorescence resonance energy transfer (FRET)
- Biolumienscence resonacne energy transfer (BRET)
- Quantitation
- Surface Plasmon Resonance (SPR)
Definitionen:
- Fusion-(hybrid-) protein
- Reporter gene
- Selection marker
- Open Reading Frame (strict)
- ORF (common use)
Tastatur-Befehle:
= drehen,
= vor-/rückwärts,
= scrollen
- genetische Fusion zwischen einem Protein von Interesse und einem Tag oder zweiten Protein, welches wichtig für respective Assays ist (z.B. GFP)
- ein Gen, welcehs ein Protein kociert, dessen anwesenheit einfach über Visualisierung oder Aktivität bestimmt werden kann
- Gen, welches ein Protein kodiert, dass der Zelle erlaubt unter selektiven Bedingungen zu wachsen
- ein DNA-Abschnitt, welcher einem ATG Start-Codon folgt und mind. 300 Basen ohne Stopp-Codon umfasst
- ein Stück cDNA, welches für ein Protein ohne Intron und 5' oder 3' untransaltierten Regionen kodiert
Yeast-2-hybrid-Prinzip
Tastatur-Befehle:
= drehen,
= vor-/rückwärts,
= scrollen
l
Vortele vom Y2H System
Tastatur-Befehle:
= drehen,
= vor-/rückwärts,
= scrollen
- Nur DNA (ORF) gebraucht --> leichte Manipulation
- Kombination von 2 ORF über Yeast mating
- verschiedene Reporter -> colorimetric + metabolic markers
- Selektions-basiertes Screening möglich
- günstig
- kein spezielle Equipment benötigt
--> etwa 80% der Pflanzen Protein-Interaktionen sind abgeleitet von Y2H
Screening-Modes für Y2H
Vorteile
Nachteile
Tastatur-Befehle:
= drehen,
= vor-/rückwärts,
= scrollen
- Targeted binary test (1-on-1)
- Vorteil: einfacher Test für physikalische Interaktionen, Semi-quantitativ
- Nachteil: gute Hypothese notwendig, keine neuen Identifikationen
- cDNA library screen
- Vorteil: Identifikation von neuen Interaktionen, keine spezialisierte Expertise
- Nachteil: keine normalisierten Libraries -> ungewiss, was schon getestet wurde
- Matrix screen, Minipool screen
- Vorteil: Identifikation von neuen Interaktionen, normalisierte Librarie
- Nachteil: viel Robotik notwendig, ORF Kollektion notwendig
kommerziell erhältliche Affinitäts-Matrixen für Affinitäts-Purification
Tastatur-Befehle:
= drehen,
= vor-/rückwärts,
= scrollen
f
Purifikation von Proteinkomplexen aus Zellen
Tastatur-Befehle:
= drehen,
= vor-/rückwärts,
= scrollen
- Klassische Purifikation
- chem. Eigenschaften (z.B: Hydrophobizität, Größe, Ladung)
- starke Affinitäten
- Antikörper (Immunoprecipitation)
- funtional Genomics
- getaggte Proteine (universal, benötigt exogene Expression)
Tandem Affinity Purification (TAP) - Tag
Tastatur-Befehle:
= drehen,
= vor-/rückwärts,
= scrollen
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Lernkarten
Protein-Protein-INteraktions-Assay
- Binäre Interaktionsidentifikation
- Yeast-2-Hyprid (Y2H)
- Split Ubiquitin (Split-Ubq)
- Protein Arrays
- Protein complex identification
- Affinity purification (AP)- mass spectromatry (MS)
- Immunoprecipitation (IP) (with MS or Western Blot)
- Luciferase-based mammalian interactome (LUMIER)
- in vivo visualization
- Bimolecular fluorescence complementation (BiFC)
- Fluorescence resonance energy transfer (FRET)
- Biolumienscence resonacne energy transfer (BRET)
- Quantitation
- Surface Plasmon Resonance (SPR)
Definitionen:
- Fusion-(hybrid-) protein
- Reporter gene
- Selection marker
- Open Reading Frame (strict)
- ORF (common use)
- genetische Fusion zwischen einem Protein von Interesse und einem Tag oder zweiten Protein, welches wichtig für respective Assays ist (z.B. GFP)
- ein Gen, welcehs ein Protein kociert, dessen anwesenheit einfach über Visualisierung oder Aktivität bestimmt werden kann
- Gen, welches ein Protein kodiert, dass der Zelle erlaubt unter selektiven Bedingungen zu wachsen
- ein DNA-Abschnitt, welcher einem ATG Start-Codon folgt und mind. 300 Basen ohne Stopp-Codon umfasst
- ein Stück cDNA, welches für ein Protein ohne Intron und 5' oder 3' untransaltierten Regionen kodiert
Yeast-2-hybrid-Prinzip
l
Vortele vom Y2H System
- Nur DNA (ORF) gebraucht --> leichte Manipulation
- Kombination von 2 ORF über Yeast mating
- verschiedene Reporter -> colorimetric + metabolic markers
- Selektions-basiertes Screening möglich
- günstig
- kein spezielle Equipment benötigt
--> etwa 80% der Pflanzen Protein-Interaktionen sind abgeleitet von Y2H
Screening-Modes für Y2H
Vorteile
Nachteile
- Targeted binary test (1-on-1)
- Vorteil: einfacher Test für physikalische Interaktionen, Semi-quantitativ
- Nachteil: gute Hypothese notwendig, keine neuen Identifikationen
- cDNA library screen
- Vorteil: Identifikation von neuen Interaktionen, keine spezialisierte Expertise
- Nachteil: keine normalisierten Libraries -> ungewiss, was schon getestet wurde
- Matrix screen, Minipool screen
- Vorteil: Identifikation von neuen Interaktionen, normalisierte Librarie
- Nachteil: viel Robotik notwendig, ORF Kollektion notwendig
kommerziell erhältliche Affinitäts-Matrixen für Affinitäts-Purification
f
Purifikation von Proteinkomplexen aus Zellen
- Klassische Purifikation
- chem. Eigenschaften (z.B: Hydrophobizität, Größe, Ladung)
- starke Affinitäten
- Antikörper (Immunoprecipitation)
- funtional Genomics
- getaggte Proteine (universal, benötigt exogene Expression)
Tandem Affinity Purification (TAP) - Tag
d
