Pflanzenbio Teil 7

• Causativ, also notwendig und hinreichend
• Correlativ, also notwendig aber nicht hinreichend

z.B. Intrazelluläre Lokalisierung notwendig für Proteinfunktion aber nciht hinreichend dafür

Erzeugen eines Knock-outs in jedem Gen

Erzeugen einer umfassenden Transkriptom-Analyse

• Gendeletion durch homologe Rekombination funktioniert nicht
• knock-out des Gens durch Insertion von t-DNA oder Transposons
• RNAi (Problem: wird nach ca. 2 Generationen gesilenced)
• Punktmutation

--> Erzeugen einer Sequence-indexed Library von Insertionsmutationen durch EInfügen von T-DNA --> Amplifikation mittel PCR und Sequenzierung der flankierenden DNA

• für unterschiedliche Gewebe und Entwicklungsstadien
• bei unterschiedlichen Bedingungen (z.B. Licht, Tageslänge, Pathogeninfektion)
• Zusammenfassung der ERgenisse in Datenbank

Problem: Knock-outs haben oft keinen sichtbaren Phänotyp aufgrund von Kompensationsmechanismen (hauptsächlich) oder funktionelle Redundanz (z.B. aufgrundvon Genduptlikation)

--> stattdessen: Verwendung des Transkriptionsprofils unter verschiedenen Umständen um Phänotyp abzuschätzen

Phänotypen gibt es für:

• Gene, de nur einmal im Genom vorkommen
• Molekulare Schalter, die eine große Anzahl von Genen die an einem spezifischen Prozess beteiligt sind, kontrollieren (z.B. Transkriptionsfaktoren)

Metabolom = Set von Metaboliten, de von einem biologischen System synthetisiert werden

• Separation der Metaboliten durch Gaschromatographie oder flüssige Chromatographie
• Detektion durch Massenspektrometrie oder NMR
• betrachtet relative Veränderungen Mutanten vs. Wildtyp

--> Wen forward Genetivs nicht funktioniert weil kein Phänotyp vorliegt und man auch mit reverse Genetics für die meisten Mutationen keinen finden kann --> Abschätzen der FUnktion phänotyplos mutierender Mutanten durch Protein-Protein-INteraktionen mit Proteinen, die bei Mutation eine Phänotyp haben

1. Mutanten werden durch Integration eines DNA-Fragmentes (z.B. T-DNA oder Transposon) erzeugt
2. Isolation der gewünschten Mutanten durch spezifisches Screening (rezessive Vererbung, also homozygote Mutante )))
3. Genisolation durch bekannte in Genom-integrierte DNA-Sequenz (z.B. über Polymerase-Ketten-Reaktion))

• gram-negatives Bodenbakterium (Pflanzenpathogen: verursacht den Wurzelhalstumor bei Dicotylen, unter Kulturbedingungen auch Monocotyle wie Reis, Mais)
• Pflanzenkontakt: EInschleusen der einzelsträngigen T-DNA (23kb), Region des Ti-Plasmids, INtegration ins WIrtsgenom, T-DNA
• Gene für Auxin- und Cytokininbiosynthese Gene für Opinbiosynthese eukaryotsiche Transkription)
• genom enthält 4 genetische Elemente:
  • circulares Chromosom
  • lineares Chromosom
  • plasmid pAtC58
  • plasmid pTiC58

• Kritische Schritte im Bakterium
  • chemische Signale
  • vir Gen-induktion
  • T-DNA Prozessierung
• Kritische Schritte in der Pflanzenzelle
  • bakterieller ANhang
  • T-DNA-Transfer
  • nuklear targeting
  • T-DNA INtegration

1. 4 genetische Elemente des Agrobacterium Genoms
   1. zirkuläres CHromosom
   2. lineares Chromosom
   3. Plasmid (pAtC58)
   4. Ti-Plasmid (pTiC58) --> codiert für Typ IV Sekretionssystem, das ebenfalls davon codierte T-DNA und daran gebundenes VirD2 in Pflanzenzelle transportiert -> INtegration ins Genom --> drch Ersetzen der T-DNA mit rekombinaner DNA verhindert Tumorgenese und erlaubt Genetic Engineering
2. Expression der wildtyp T-DNA-kodierenden Gene führt zu tumorigenesis

1. assoziierende Proteine werden abgestoßen
2. umgewandelt zu einer Doppelsträngigen Form, de mit den Komponenten der Wirts-DNA-Reparatur assoziiert (z.B. DNA PK, Ku70, Ku80)
3. interagiert mit dem Doppelstrangbruch (DSB) in der Wirts-DNA
4. intergriert in das Wirts-Genom über die AKtivität der Wirt-Ligase

• post-transcriptional Gene Silencing (PTGS) -  SIlencing von endogenen Genen durch die Einführung homologer dsRNA, Transgenen oder Viren. Bei PTGS wird das Transkript der gesilenceden Genen synthetisiert, aber nicht angehäuft sondern abgebaut. 
• RISC- RNA-induced silencing complex: ein Nuklease-Komplex, bestehend aus Proteinen und siRNA, der endogene mRNA anfisiert und zerstört
• RNA interference (RNAi) post-transkriptionales Gene-Silencing (PTGS) induziert durch die direkte Einführung von dsRNA
• siRNAs- Small interfering RNAs. Modell von PTGS zeigt, dass 21-23 nuc. dsRNAs PTGS herbeiführen. siRNA werden in vivo produziert, indem dsRNA geschnitten wird, oder durch Transgene oder Viren. Amplifikation einer RNA-abhängigen RNA-Polymerase kann im selben Organismus auftreten

f

• Vorteil: dominante Wirkung und Knockdown homologer Zielsequenzen
• Nachtel: partieller Knockdown, transitorische RNAi = RNA-abhängige RNA-Polymerase verlängert an mRNA-gebundenen siRNA -> Abbau der dsRNA durch RISC -> RNA-Fragmente binden an Ago -> Silencing anderer Gene

• einzigartige Gene (ohne Kopie) - ca. 30% des Genoms
• molecular switches, die eine große Anzahl an Genen kontrollieren, die in einen specifischen Prozess involviert sind

Transkriptionsfaktoren >1533 (ca. 5,9% des Proteoms)

• interagieren Physikalisch (z.B. im Proteinkomplex)
• agieren nacheinander in einem Pathway
• agieren in einer regulatorischen Art und Weise

sie funktionell verwandt sind

Pathway = metabolisch, in der Entwicklung oder in der Signaltransduktion

• biochemische Methoden
• yeast Two-Hybrid
• Doppelmutanten-Analyse
• Computergestützte Methoden

• Doppelmutanten-Analyse
• Computergestützte Methoden

• alle Gene identifizieren, die zu einem bestimmten Phäntyp mutieren
• Doppelmutanten-Analyse für Mutanten mit zusammenhängendne Phänotyp
• Vorgehensweise:
  • durch genetisches Screening identifizieren aller Gene, die zu einem bestimmten Genotyp mutieren -> diese Gene sind Kandidaten für genetische Interaktion
  • Beispiel:

• Doppelmutante AB ist der gleiche Effekt wie einfache Mutante A
  • ab=a --> a ist epistatisch über b
  • bedeutet nicht zwingend, dass A vor/upstream von B wirkt
  • z.B. A inhibiert B
• Epistasis bedeutet, dass zwei Gene im gleichen Pathway in einer Sequenz von Vorgängen agieren
• Vergelcih mit Dominanz: DOminanz bezieht sich auf die Allele eines einzelnen Gens <--> Epistasis bezieht sich auf die Beziehung von zwei unterschiedlichen Genen

Doppelmutante liefert den Wildtyp-Phänotyp --> zusammen funktionieren die beiden Mutationen wie der Wildtyp

• Synthetic Enhancement/ Lethality
• Doppelmutanten von Genen, die interagieren, liefern einen synthetisch lethalen Phänotyp der wesentlich ausgeprägter ausfällt als ein lediglich additiver Effekt, wie er bei unabhängigen Genen auftreten würde --> Synergie z.B. bei Proteinkomplexen oder funktioneller Redundanz

1. Experimenten auf globalen Level
2. Datenintegration
3. Systemmodellierung
4. Generierung von Hypothesen
   1. Diese Hypothesen führen zum Design eines neuen Experimentes, welches eine neue Runde im Zyklus einführt
   2. Jede Wiederholung verfeinert das Modell und vertieft unser biologisches Verständnis des Systems

Stammzellforschung

• Stammzellen teilen sich assymmetrisch
• Stammzellnischen
• offene Fragen in der Stammzellforschung
• Beispiel für Modeling