Pflanzenbio Teil 2

• Phänotyp --> Genotyp (mit hilfe von LIchtmikroskopie, Dissecting Scope, ANtikörper-Färbungen, konfokal- und ELektronenmikroskopie)
• einer biologischen Frage (z.B. Lichtantwort, Wasserstatus, Entwicklung, Biotische und abiotische Stressantwort)
• Untersuchung der AUfspaltung nach Mendel um festzustellen, ob der Phänotyp durch Mutationen in einem oder mehreren Genen verursacht wird -> Rückkreuzung mit Wildtyp-ELter

Intensität

Dauer

Qualität

Schatten

Jahreszeit

Tageszeit

j

EMS (ethylmethane sulfonate, verursacht G/C-A/T Transition)

• HYY agiert im Licht
• HY zeigt Hypocotyl Wachstum im Licht
• COP zeigt Lichtantwort im DUnkeln

• HYY agiert im Licht
• HY zeigt Hypocotyl Wachstum im Licht
• COP zeigt Lichtantwort im DUnkeln

• keine WUrzel
• Primärer Defekt in gnom, keule und fass: Probleme bei der Zellteilung
• --> assymetrische Zellteilung = 2 Tochterzellen haben unterschiedliche Schicksale, asymmetrische Teilungen sind charakterisiert  durch:
  • ERzeugung von Polarität (z.B. Teilung der Zygote in apikale Zelle -> Embryo und basale Zelle -> Suspensor)
  • Ungleiche Verteilung von Zellkomponenten auf die Tocherzellen
• Teilungsort der Zelle wird bestimmt durch Position des Nukleus in der Interphase -> markiert durch RIng aus Mikrotubuliiii in der Prä-Prophase --> während der Cytokinese wird dort Sellwand/Zellmembran durch Vesikelfusion erzeugt
• Defekt in fass: der Mikrotubuliring in der Prä-Prophase fehlt -> zufällige Teilungsebenen -> schiefe Zellteilungen
• Defekt in Keule: unvollständige Zellkerne und mehrere Nuclei pro Zelle -> Bildung der Zellwand zwischen 2 Tochternuklei funktioniert nicht -> Keule beteiligt an Cytokinese: Vesikel für Zellwand gelangen zum Äquator aber verschmelzen nicht -> Genfunktion = FUsion von Vesikeln die neue Zellwand bilden
• Defekt in gnom: keine AUsbildung der Polarität der Zelle

Zellwand bestimmt positionele Information: Zygote von ALge FUcus teilt sich in 2 Zellen : Thallus (oben) und Rhizoid. Bei Entfernen der Rhizoid-Zelle: nach Zellteilung entstehen 2 Thalluszellen, aber wenn Zellwand stehenbleibt wird Rhizoid nachgebildet

ein Organ oder Körperteil ist durch ein anderes Organ oder Körperteil ersetzt (z.B. Antennapedia))

-> solche Gene codieren Master switches oder Key regulators der Entwicklung

-> Homöotische Gene in Dorsophila: haben eine 60 AS Homöodomäne, die an DNA bindet -> codieren für Key Regulators der Transkription

GEN                  biolog. ROlle                                    Molekulare FUnktion

COP1                Skotomorphogenese                                  

HYY5                 Photomorphogenese

Monopteros      Wurzelentwicklung

FASS                 Teilungsebene                                                Cytoskelett

GNOM              Zellpolarität

KEULE              Cytokinese                                                       Vesikeltransport

KNOLLE             Cytokinese                                                       Vesikeltransport            

• Mutantenphänotyp verursacht durch eine Mtation in einem einzigen Gen --> Gen unbekannt, aber kann gegen bekannten Marker kartiert werde
• bekannte molekulare Marker

wenn Gen nahe am Marker liegt -> wenig/keine Rekombination zwischen Gen und Marker, wenn sie weiter auseinander liegen gibt es Rekombination

• zuerst Mapping des Gens gegen bekannte Marker auf jedem CHromosom -> Zuordnung des Gens zu einem Chromosom
• designen von näher liegenden Markern auf dem Chromosom
• Festlegen der Lokalisierung des Gens zwischen zwei Markern
• Sequenzieren des Abschnitts in WIldtyp und Mutante zur Identifikation der Mutation
• Überprüfung ob es sich um richtiges Gen handelt durch Komplementationsanalyse

--> Sequenzinformation würde positionelles Cloning erleichtern

Expressed Sequence Tags

mRNA wird revers transkribiert zu cDNA, die aber nciht immer die komplette Länge haben --> Aussequenzieren liefert überlappende Sequenzen die zu EST contig assembliert werden können

• Einheit: cM:: centi-Morgan (physikalische Karte:: basepair, bp)
• ursprünglich basierend auf sichtbaren (phäntypischen) Markern
• für hochaufgelöste genetische Karten auch Betrachtung "stiller" Mutationen ohne Phänotyp --> Verwendung molekularer Marker -> DNA-Polymorphismen

• direkte Visualisierung   von DNA-Polymorphismen durch Hybridisierung oder PCR 
• für Kartierung:: Verwendung verschiedener Ökotypen von Arabidopsis: Landsberg erecta (=Ler) und Columbia (=Col)
• als Marker werden verwendet: RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms), CAPs (Cleaved Amplified Polymorphisms), SNPs, SSLPs (Simple Sequence Length Polymorphisms)
• SSLPs entstehen durch verrutschtes Crossing Over an Positionen mit wiederholten kurzen Sequenzen -> Mikrosatelliten: unterschiedlich viele Repeats einer einfachen kurzen Sequenz

• direkte Visualisierung   von DNA-Polymorphismen durch Hybridisierung oder PCR 
• für Kartierung:: Verwendung verschiedener Ökotypen von Arabidopsis: Landsberg erecta (=Ler) und Columbia (=Col)
• als Marker werden verwendet: RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms), CAPs (Cleaved Amplified Polymorphisms), SNPs, SSLPs (Simple Sequence Length Polymorphisms)
• SSLPs entstehen durch verrutschtes Crossing Over an Positionen mit wiederholten kurzen Sequenzen -> Mikrosatelliten: unterschiedlich viele Repeats einer einfachen kurzen Sequenz

• genetische und molekulare Marker
• hochaufgelöste genetische Karte
• Bacterial Artificial Chromosomes ((=BACs)
• Physikalische Karte (d.h. Anzahl bp zwischen 2 Markern)

• enthalten normalerweise ~100kb (aber auch bis zu 300kb)
• stabile Vektoren von denen leicht große Mengen präpariert werden können
• Ori S und Rep T: Replikatikon des F-Faktors in eine Richtung
• ParA und ParB regulieren Kopienzahl
• positiver Selektionsmarker: CHloramphenicoolresistenz
• Cloning Strip für Insertion fremder DNA
• BAC-Klone werden auf physikalischer Karte aligned durch FIngerprinting -> Restriktionsverdau der BAC-Klone und Suche nach überlappenden Restriktionsfragmenten zur ANordnung der BACs in physikalischer Karte --> Suchern der Klone mit minimaler Überlappung = minimal tiling path --> Sequenzierung der Klone und Assemblierung der Sequenzen der Klone aus dem sequenzierten Contigs -> Überlappung der Fragmente liefert Merged Sequence Contigs -> Orientieren und ANordnen der Contigs

• Ordered Clone Sequencing
  • zuerst Erstellen einer physikalischen Karte
  • Erstellen eines Minimal Tiling Path durch geordnete Untergruppe minimal überlappender Klone
  • Jeder BAC durch Shotgun Sequencing sequenzieren: 1-2 kb lange DNA-Fragmente von beiden Enden sequenziert und aligned
  • Verwendet für Wurm,  Arabidopsis, Mensch
• Whole Genome Shotgun Sequencing
  • Sequenzierung zufällig ausgewählter Klone
  • homologe Sequenezen alignen
  • Vorteil: keine Physikalische Karte nötig
  • Nachteil: große Lücken, Probleme mit repetitiven Sequenzen
  • verwendet für Fliegen