PCR & qPCR

• Template-DNA
• zwei unterschiedliche Primer
• DNA-Polymerase
• vier dNTPs
• Salz mit 2wertigem KAtion (z.B: Mg2+)
• Puffer mit einfachem Salz (z.B. KCl)

1. Denaturation (92°-96°)
   Denaturierung der DNA-Doppelhelix
2. Annealing (58°)
   Primer Hybridisieren mit Einzelstrang
3. Extension (72°)
   Verlängerung des Strangs durch die Polymerase
4. Repetitive cycling
   1-3 werden wiederholt bis genug amolifiziert wurde (30-40x)

Jedes neu erzeugte Fragement wird sofort als Template verwendet

--> exponentielle Vermehrung

Reverse-transcriptase PCR

NAchweis udn Analyse von RNA-Expression, bzw. Klonierung exprimierter Gene

am Beginn die aus E-coli, aber nicht hitzestabil, musste nach jedem Zyklus neu zugestetzt werden

taq-Polymerase

• aus thermus aquaticus
• bei 90° noch aktiv

Pfu-Polymerase

• Archaea Pyrococcus furiosus
• lebt bei mehr als 100°

unterscheiden sich in Qualitäten, z.B. 3-5-Exonuklease-Aktivität --> Qualität des erzeugten Fragments

sind erst bei hohen Temperaturen aktiv, soll verhindern, dass die Polymerase unspezifische Bidnungen (z.B: Primer-Dimere) als start-Signal ansieht

Pol. erst bei erstem Denaturierungsschritt aktiv,

Inaktivierung durch z.B: Ligand-Ihibierung

Inhibierung der Pol. durch Temperatur-abhängige Bindung eines Liganden (AK, oder Aptamere)

Ligand bindet bei niedrigen Temperaturen an die active site der Pol.

Bei höheren Temperaturen löst er sich ab --> Pol kann arbeiten.

bei niedrigen Temperaturen bindet Ligand erneut

(auch durch chem. Modifikation möglich, aber irreversibel aktiviert udn teuer)