"Nukleinsäuren untersuchen"
BTA, C5
BTA, C5
Fichier Détails
| Cartes-fiches | 22 |
|---|---|
| Langue | Deutsch |
| Catégorie | Chimie |
| Niveau | Apprentissage |
| Crée / Actualisé | 05.02.2015 / 14.11.2020 |
| Lien de web |
https://card2brain.ch/box/nukleinsaeuren_untersuchen
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| Intégrer |
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Beschreiben Sie das Prinzip der klassischen DNA-Sequenzierung nach Sanger und erläutern Sie dabei die Abbildung!
-Kettenabbruch durch ddNTP's da sie Polymerase nicht an ein freies 3'OH binden kann
-Primer ... (algo qué no entendí... blablabla)
-4 Pötte mit jeweils einer Sorte der ddNTP's und dNTP's -> zufälliger Einbau
-Unterschiedlich große Fragmente -> PAGE
-Ablesen der Basenabfolge (vom Bild) von unten nach oben, da die erste Base der Sequenz am kleinsten ist und somit ganz unten
Analysieren Sie die Basensequenz auf dem Sequenzgel und markieren Sie das 5'- und 3'-Ende der DNA.
5'-CTTGCTAATCCTCCTCCTCCTCCGGATTCGG-3'
Beschreiben Sie kurz Besonderheiten dieser DNA-Sequenz. Diskutieren Sie um welches genetische Element es sich handeln könnte!
Wiederholung (5x) der 3 Basen TCC in der gleichen reihenfolge
->repetetive Sequenz = Tandemrepeat
=>Mikrosatellit (sehr kurz; 2 bis 4 Raster)
->STR
...nicht vollständig!! ... da muss noch mehr hin
I) Sie sollen die Expression des Gens MIZIP bei Mäusen mit Hilfe der PCR untersuchen. Dazu haben Sie mit Hilfe des Programms Primer-BLAST folgendes Primerpaar gefunden:
Forward Primer: 5'-AACAGCTCATGGCAGCGCATC-3'
Reverse Primer: 5'-GTTCAGGTGCAGAGGCCAGG-3'
a) Errechnen Sie Tm für beide Primer.
Tm(Forward)= 4*(12)+2*(9) = 66°C
Tm(Reverse)= 4*(13)+2*(7) = 66°C
II) Sie sollen die Expression des Gens MIZIP bei Mäusen mit Hilfe der PCR untersuchen. Dazu haben Sie mit Hilfe des Programms Primer-BLAST folgendes Primerpaar gefunden:
Forward Primer: 5'-AACAGCTCATGGCAGCGCATC-3'
Reverse Primer: 5'-GTTCAGGTGCAGAGGCCAGG-3'
b) Überprüfen Sie, ob dieses Primerpaar für eine PCR geeignet ist. Diskutieren Sie 4 Kriterien!
-annealing Temperatur = 66°C
-> 66°C - ca. 5°C =61°C => geeignet + beide identisch
-GC-Gehalt -> Forward 57%, Reverse 65%
[sollte zwischen 40% und 60% liegen!] => relativ hoch!!
-mindestens 17 Basen lang (-> hier: 20 und 21)
-am 3'-Ende G oder C -Base (Forward 1[..C-3'], Reverse 2[...GG-3'])
=> GC-Gehalt relativ hoch, ansonsten gut
III) Sie sollen die Expression des Gens MIZIP bei Mäusen mit Hilfe der PCR untersuchen. Dazu haben Sie mit Hilfe des Programms Primer-BLAST folgendes Primerpaar gefunden:
Forward Primer: 5'-AACAGCTCATGGCAGCGCATC-3'
Reverse Primer: 5'-GTTCAGGTGCAGAGGCCAGG-3'
c) Sie haben beide Primer mit c=200pmol/mikroL bekommen.
In Ihren PCR-Ansätzen benötigen Sie jeweils eine Endkonz. von 1poml/mikroL Primer.
Sie sollen nun 500mikroL Primerstammlsg. herstellen. Die Primer-Konzentration soll dabei so eingestellt werden, dass die Primerstammlsg. bequem 1:10 zu den PCR-Ansätzen gegeben werden kann!
Errechnen Sie zuerst die Konz. der Primerstammlsg. und beschreiben Sie Ihr weiteres praktisches Vorgehen (mit Rechenwegen!).
IST c=200pmol/mikroL
SOLL c=10*1pmol/mikroL
c(Stammlsg.)=10*1pmol/mikroL = 10pmol/mikro
->200pmol/mikroL : 10pmol/mikroL= 20
->500 : 20 = 25mikroL
=> d.h. 25mikroL Primer +(500mikroL - 25mikroL = ) 475mikroL ddH2O
...Sobald ich meine 2 Komponenten der Lsg. zusammengegeben habe homogenischiere ich die Mischung. => Voilá, fertig!
I) Sie sollen mit Hilfe der klassischen PCR nachweisen, ob MIZIP im Gehirn der Maus exprimiert wird. Neben den PCR-Reagenzien bekommen Sie eine cDNA-Probe aus Niere als Positivkontrolle und eine cDNA-Probe vom Mausgehirn.
a) Nenne Sie 5 Bestandteile des PCR-Master-Mix und die jeweilige Bedeutung für die PCR.
-Mg2+-Ionen (MgCl2) -> Cofaktoren (essentiell) für die Polymerase
-Taq-Polymerase -> hitzebeständige Polymerase, verlängert den DNA-Strang
-DNA-Primer (Forward & Reverse) -> Anlagerungsstellen (freies 3'OH) für die Polymerase
-dNTP's -> Bausteine der neusynthethetisierten DNA
-Puffer -> Optimales Milieu für die Polymerase
II) Sie sollen mit Hilfe der klassischen PCR nachweisen, ob MIZIP im Gehirn der Maus exprimiert wird. Neben den PCR-Reagenzien bekommen Sie eine cDNA-Probe aus Niere als Positivkontrolle und eine cDNA-Probe vom Mausgehirn.
a) Wie viel mikroL Master-Mix müssen Sie herstellen, wenn jeder PCR-Ansatz aus 20mikroL besteht, einschließlich 2 mikroL cDNA (Mit Rechenweg!)?
3*(20mikroL-2mikroL)=54mikroL
10% von 54mikroL= 5,4
(ich setzte 54mikroL +ca. 10% extra an, damit ich die korreke Menge pipettieren kann!)
=> 59,4mikroL Master-Mix (59mikroL würden aber auch ausreichen)
III) Sie sollen mit Hilfe der klassischen PCR nachweisen, ob MIZIP im Gehirn der Maus exprimiert wird. Neben den PCR-Reagenzien bekommen Sie eine cDNA-Probe aus Niere als Positivkontrolle und eine cDNA-Probe vom Mausgehirn.
c) Die Primer (vgl. Aufgabe 3a) vervielfältigen von der cDNA ein MIZIP-Fragment von 886bp. Als Polymerase verwenden Sie eine Taq-Polymerase, die 44bp pro/sek. replizieren kann.
Entwerfen Sie ein PCR-Programm mit 35 Zyklen zur Amplifikation der MIZIP-Fragments.
Begründen Sie dabei stickwortartig Ihre Wahl der Annealing-Temperatur, der Elongationszeit und was in jeder Phase der PCR passiert!
-Annealing-Temperatur => liegt ca.5°C unter der Schmelztemperatur der Primer, alo bei ca. 61°C
-Elongationszeit => 886bp : 44bp/sek.= 20 sek. (+10sek. "Anlagerungszeit" für die Polymerase)
-Phasen der PCR:
-> Initiale Denaturierung -> um sicherzugehen, dass sich aus ds-cDNA komplett einzelstränge cDNA (ca.94°C/ 2 min.)
1) Denaturierung: erste Phase des Zykluses (ca.94°C/30 sek.)
Ausgangs-DNA & Primer vollständig voneinander getrennt haben und nur noch Einzelstränge vorliegen
H-Brückenbindungen (die die beiden DNA-Stränge zusammenhalten) werden aufgebrochen
2) Annealing: ca. 30 Sekunden bei 61°C! Dieses ermöglicht eine spezifische Anlagerung der Primer an die DNA!!
-Temperatur zu niedrig -> Primer lagern u.U. auch an nicht-100-%-komplementären Sequenzen an => unspezifischen Produkten („Geisterbanden“)
-Temperatur zu hoch -> thermische Bewegung der Primer u. U. so groß, dass sie sich nicht richtig anheften können => gar keine / ineffizienter Produktbildung!
3) Elongation: ca. 30 sek. je 500bp DNA-Polymerase fängt Arbeit an!! Beginnt am 3'-Ende des angelagerten Primers, folgt dann dem DNA-Strang; Primer wird nicht gelöst, bildet den Anfang der neuen ssDNA.
-Temperatur & Zeit hängt vom Arbeitsoptimum der Polymerase ab (68–72 °C).
=> Phase (1 bis 3) x35
Vollendung der Zyklen: bei ca. 4 °C lagern bis zur Weiterarbeit
Nennen Sie jeweils eine Fragestellung für die Northern-Blot-Analyse und die RNA-in-situ-Hbridisierung, die nicht durch eine RT-PCR beantwortet werden kann (mit Begründung!).
Northern-Blot -> Beweisen Sie, dass es bei der mRNA alternatives Spleißen gibt.
=> Durch die markierten Sonden lassen sich autoradiographisch die Sleiß-Produkte erkennen! Bei der RT-PCR werden nur def. Fragmente vervielfältigt.
RNA-ISH -> Wo im Körper der Maus kommt es noch zur Expression von MIZIP?
=> In fixierten Organismen kann man durch Markierungsmoleküle das Vorhandensein der mRNA erkennen! Bei der RT-PCR arbeitet man mit Zellextrakt und ...
Beschreiben Sie stichwortartig das Vorgehen bei einer Northern-Blot-Analyse und einer RNA-ISH.
Northern-Blot
1)Gelelektrophorese
2) Blotten
3)Nick Translation
4)Markierung mit Sonden
=> Hybridisierung mit RNA
5)Autoradiografie
6)Auswertung
RNA-ISH
1)Herstellung einer markierten Sonden (z.B. durch Nick Translation)
2) Gewebe/ Organismus fixieren (ggf. schneiden)
3)Hybridisierung der Sonde mit RNA
4)Autoradiografie (möglicherweise auch fluoreszenz
5)Auswertung
Sie führen eine Light Cycler-PCR mit 4 Ansätzen durch und setzen dabei folgende Verdünnungen der Template-DNA ein: 1:100; 1:1000; 1:10^4; Negativkontrolle.
Erläutern Sie kurz die zu erwartenden Fluoreszenzkurvenverläufe der 4 Ansätze.
Sie haben folgende Primer-Sequenzen für die Amplifizierung des IGF1-Gens:
sense: 5'-AGAGCCTGCGCAATGGAATA-3'
antisense: 5'-ACCCTGTGGGCTTGTTGAAA-3'
Berechnen Sie das Molekulargewicht und die Schmeztemperatur der Primer.
Molekulargewicht = 330 g/mol * Anzahl der Basen (hier: je 20)
= 330g/mol*20
=6600g/mol => gilt für beide Primer!
Schmelztemperatur [tm] = 4*(G/C) + 2*(A/T) (hier: je 10)
= 4*10 + 2*10
= 60°C => gilt für beide Primer!
Zeichnen Sie schematisch den Mechanismus der PCR-Reaktion bis zum 3. Zyklus (beschriften Sie ihre Zeichnung!)
Tatarata
Analysieren Sie mit Hilfe des in dem Bild gezeigten Sequenzabschnittes des IGF1-Gens, ob das folgende Primerpaar für die PCR geeignet ist und begründen Sie dies anhand Ihnen bekannter Kriterien, die für die Ermittlung von Primer-Sequenzen zu beachten sind.
sense: 5'-AGAGCCTGCGCAATGGAATA-3'
antisense: 5'-ACCCTGTGGGCTTGTTGAAA-3'
[+] 50% G/C-Gehalt => liegt im Optimalbereich von 40-60%
[+] 20 Basen lang => liegt im Optimalbereich von 18-30 Basen
[+] Primer sind nicht komplimentär zueinander (sonst Gefahr auf viele Primer-Dimere)
[+] Schmelztemperatur 60°C => liegt im Optimalbereich von 50-65°C
[+] Schmelztemperatur bei beiden Primern gleich
[-] Adenin an 3'-Enden => an jenen sollten 1-3 G/C stehen
-> Primer sind nicht optimal, jedoch trotzdem geeignet.
Entwerfen Sie ein mögliches PCR-Programm zur Amplifikation des PCR-Produkes des IGF1-Gens unter Benutzung der genannten Primer und der Pfu-Polymerase.
Deckelheizung 110°C
Initiale Denaturierung: 10 - 15 min./ 94°C
PCR-Zyklen (x30):
Denaturierung 30sek./ 94°C
Annealing 30-60sek./ 3-5°C unter der Schmelztemperatur
Elongation 2*Länge in bp/ Arbeitstempo der Polymerase
=> 2*370bp/ 20bp/sek. = 37sek. aufrunden -> 60sek.
Abschlusselongation 10min/72°C
bis weiter gearbeitet wird: Lagerung bei 4°C
Sie haben von einer Firma die Primer in Reaktionsgefäßen lyophilisiert erhalten. Sie lösen die Lyophilisate jeweils in 50mikroL ddH2O. Dadurch erhalten Sie für den sense-Primer eine Konz. von c=1nmol/mikroL, für den reverse-Primer jedoch c=0,5mikromol/mikroL.
In den PCR-Ansätzen benötigen Sie jeweils eine Endkonz. von 10pmol/mikroL Primer. Dafür sollen Sie nun aus den gelösten Lyopilisaten 100mikroL Primerstammlsg. herstellen. Die Primerkonz. soll dabei so sein, dass sie bequem 1:10 zu den PCR-Ansätzen gegeben werden können!
Errechnen Sie zuerst die Konz. der Primerlsg. und beschreiben Sie die praktischen Vorgehensweisen (mit Rechenweg!)
>> Benötigte Konz. der Stammlsg. => 10*10pmol/mikroL =100pmol/mikroL
sense-Primer: 1000pmol/mikroL : 100pmol/mikroL =10 (Verd.f.)
100mikroL (Gesamtvol.) : 10 (Verd.f.) = 10mikroL Primerlsg.
100mikroL (Gesamtvol.) - 10mikroL (Primerlsg.) = 90mikroL H2O
=> 10mikroL Primerlsg. und 90mikroL H2O zusammenpipettieren & homogenisieren
reverse-Primer: 500nmol/mikroL : 5nmol/mikroL =100 (Verd.f.)
100mikroL (Gesamtvol.) : 100 (Verd.f.) = 1mikroL Primerlsg.
100mikroL (Gesamtvol.) - 1mikroL (Primerlsg.) = 99mikroL H2O
-> Verd.1: 1mikroL Primerlsg. und 99mikroL H2O zusammenpipettieren & homogenisieren
5nmol/mikroL : 0,1nmol/mikroL =50 (Verd.f.)
100mikroL (Gesamtvol.) : 50 (Verd.f.) = 2mikroL Primerlsg.
100mikroL (Gesamtvol.) - 2mikroL (Primerlsg.) = 98mikroL H2O
=> Verd.2: 2mikroL Primerlsg. und 98mikroL H2O zusammenpipettieren & homogenisieren
Beschreiben Sie, wie die Anzahl der Kopien des IGF1-Gens der unbekannten Probe bestimmt werden kann, geben Sie den Zahlenwert an und berechnen Sie die Zahl an Kopien pro Insulinproduzierender Zelle des Pankreas.
Bestimmung der Anzahl der Kopien der unbekannten Probe:
Stelle auf dem Diagramm suchen, an dem die Kalibriergerade schneidet eine ausgewählte Anzahl von Zyklenschneidet. Der jeweilige x-Wert ist dann die Kopienzahl.
In diesem spezifiscen Beispiel ist die Anzahl der Zyklen 7 und die Anzahl der Kopien dementsprechend ca. 5*10^7
Bestimmung der Anzahl der Kopien der insulinproduzierender Pankreaszellen:
5*10^9*0,66 = 3,33*10^9 insulinproduzierende Zellen
5*10^7*1000 : 3,33*10^9 = 9,6 Kopien pro insulinproduzierende Zelle
Erläutern Sie mit Hilfe schematischer Zeichnungen das Prinzip der Nachweismethode einer qPCR mit SYBR-Green und ROX. Erläutern Sie zudem wesentliche Vor- und Nacheteile dieses Verfahrens.
SYBR-Green ist ein sequenzspezifischer Fluoreszenzfarbstoff, der sich nur in dsDNA einlagert. Die Fluoreszenz erhöht sich proportional zu der Menge an Material. Die Messung muss nach der Elongation stattfinden.
ROX ist ebenfalls ein Fluoreszenzfarbstoff, jedoch baut er sich nicht in die DNA ein. Die "ROX-Fluoreszenz" wird benötigt um den Hintergrund zu berechnen.
[+] Verfahren ist günstig und einfach
[-] sequenzspezifisch -> hohe Templatereinheit gefordert (da jede dsDNA markiert wird)
[-] lichtempfindlich
Nennen Sie 5 Unterschiede zwischen der klassischen und der modernen Sequenzierung nach Sanger.
modern - vs. - klassisch
1 Ansatz - 4 Ansaätze
Fuoreszenzfarbstoff - radioaktive markierung
Detektion während des Laufs- nach dem Lauf Autoradiographie
bis zu 800bp - bis zu 500bp
Auswertung am Compu - manuelle Auswertung
Ermitteln Sie die Basensequenz des Sequenzgels und markieren Sie das 5'- und 3'-Ende der DNA.
5'-TATCGGCAGGCAGGCAGGCAGGCATTCAACCA-3'
Analysieren Sie diese DNA-Sequenz. Beschreiben Sie ein genetisches Element innerhalb dieser Sequenz:
5'-TATCGGCAGGCAGGCAGGCAGGCATTCAACCA-3'
5'-TATC|GGCA|GGCA|GGCA|GGCA|GGCA|TTCAACCA-3'
=> 5xWiederholung der Basenabfolge GGCA
-> jenes ist ein STR (short tandem repeat) [= sehr kurze sich wiederholende Sequenz]
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