Molekulare Physiologie der Prokaryoten

- Plate T-Streak

- TLC-overlay

- Quantification assays

- In vivo assay:

• - GFP-basierende Biosensoren

• AHL-Abwesenheit: R (Response-Regulator) kann nicht an QS-regulierten Promoter binden und somit erfolgt keine Expression von Gfp (Reporter-Gen)
   
• AHL-Anwesenheit: Response-Regulator kann an den QS-regulierten Promoter binden,
  welches gfp reprimiert und eine Expression von Gfp-Sensor (Reporter-Gen) erfolgt; durch
  Biolumineszenzzellen kommt es zum Leuchten der Zellen

• - gramnegative Bakterien sind kommunizieren über Acyl-Homoserin-Lactone (AHL)-Autoinducer mithilfe der LuxI-Homologen als Autoinducer-Synthetasen und LuxR-Homologen als Autoinducer-Rezeptoren
  • LuxI katalysiert die Synthese von spezifischen AHL-Autoinducer.
  • Die Autoinducer diffundieren frei in das Zellmedium, deren Konzentration nimmt mit steigender optischer Dichte zu.
  • Wenn eine Schwellenkonzentration an AHL erreicht wird, bindet dieses an das Rezeptorprotein LuxR.
  • Der LuxR-Autoinducer Komplex aktiviert die entsprechenden Zielgene

am Beispiel von Vibrio fischeri, ist ein Biolumineszierendes Bakterium, das in einer mutualistischen
Symbiose mit Bobtail-Tintenfischen lebt

•  LuxI synthetisiert AHL (Autoinductor)
• dieser (Autoinductor) diffundiert aus der Zelle raus, um sich anzureichern
• wenn AHL eine bestimmte Schwellenkonzentration erreicht, diffundiert es zurück in die Zelle
• dann bindet das AHL an das Aktivatorprotein LuxR, es kommt zu einer Konformationsänderung und somit zur Verstärkung der Transkription vom Lux-Operon
• es kommt zur verstärkten Expression von Targetgenen; im Fall von V. fischeri werden die Lux-Gene AB transkribiert und das Protein Luciferase wird synthetisiert
• durch eine Oxidation von Luciferase entsteht eine Oxiluciferase, dabei entsteht freiwerdende Energie in Form von Licht

• Signalmoleküle sind Stamm-spezifische modifizierte Oligopeptide (entstehen aus einem entschprechend prozessierten und modifizierten Präkursorprotein)
   
• werden aktiv in das umliegende Medium sezeniert mittels ATP-binding-Casette (ABC)
   
• Konzentration steigt an -> wenn Schwellemkonzentration erreicht ist, werden diese durch Zwei-Komponenten-Signal-Transduktion-System detektiert
   
• Autoinducer (AIP) wird zuerst durch eine Sensor-Kinase erkannt
   
• es folgt eine Reihe an Phosphorylierungen, die mit Phosphorylierung des zweiten Komponente, des Antwort-Regulatorproteins, endet.
   
• diese wird dadurch aktiviert
   
• bindet an DNA und aktiviert die QS-regulierten Gene
   

- am Beispiel von STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS

•  Signalmoleküle (AIP) müssen einen bestimmten Schwellenwert überschreiten
• dann kommt es zur Bindung an den Sensor (Histidin-Kinase; AgrC)
• dadurch wird die Kinase autophosphoryliert
• dies führt zur Phosphorylierung des Response-Regulators (AgrA)
• der RR  bindet wiederum an den Promoterbereich auf der DNA
• es kommt zur Aktivierung der Target-Gene, z.B. Hochregulation von Tovinen und Proteasen und Runterregulierung der Attachement- und Kolonisierungs-Faktoren
• Aktiviertes AgrA induziert auch Expression des agrBDCA. Dies führt zu einem erhöhten
  AIP Spiegel ( Synthese von Precursor-Peptiden (ArgD) als Vorstufe)
• diese können wiederum über den ABC-Transporter (ArgB)  außen gelangen

mittel AHLs

• Pseudomonas aeruginosa AHLs haben Auswirkungen auf die Morphologie von Candida albicans
  • 3-oxo-C12 Homoserinlacton hemmt C. albicans Filamentierung ohne Auswirkungen auf die Pilzwachstumsraten

mittels DSF

• P. aeruginosa "reagiert" auf Signale von Andere Arten, die Biofilm Bildung und Polymyxin Toleranz induzieren

mittels AI-2 (abgeleitet aus Methioninmetabolismus)

• Induktion der Lumineszenz bei V. harveyi durch zellfreie Kulturüberstände der nichtlumineszierenden Bakterien diverser Spezies.

• QS reguliert die Expression von Virulenzfaktoren und die Bildung von Biofilmen in vielen pathogenen Bakterien
• bilden somit attraktive neue Zielstrukturen um bakterielle Infektionen zu bekämpfen

Signalerzeugung:

• -direkte Inhibitoren/ Hemmung der AHL-Synthese
• Inhibitoren der Acyl-ACP aus Fettsäuren
• Transportblocker; den Transport aus der Zelle heraus unterbinden

Signalempfang:

• Abbau von AHLs;
• Inbeschalgnahme der AHLs: Moleküle fangen AHLs ab, bevor sie an der Rezeptor binden können
• Signal-Komkurrenz: andere Moleküle binden an den transkriptionellen Regulator und inhibieren diesen

bakterielle QS Blocker

• viele Bakterienarten sezernieren AHL-Lactonasen und öffen dadurch die Ringstruktur
• Degradation/ Abbau von AHLs durch Acylasen; spalten den Lactonring von der Acyleinheit ab

eukaryotische und „künstliche“ QS Blocker

• viele eukaryotische Pflanzen haben Strategien entwickelt um bakterielle Zell-Zell-Kommunikation zu unterbinden
• AHL-Derivate aus Pflanzen
  • Furanon C30 hat Einfluss auf das Wachstum und die Expression von Virulenzfaktoren
  • halogenierte Furanone (C56); blockiert QS und Biofilmbildung von Pseudomonas aeruginosa
  • alternative Naturstoffe; es erfolgt eine Veränderung des Signals z.B. durch Knoblauch-Extrakt oder Zimt; beeinflusst z.B. die Struktur und Resistenz von Biofilmen oder die Pathogenität bei P. aeruginosa
  • - „konkurrierende“ AHLs

gr +

- ArpA unterdrückt die Transkription von adpA durch die Bindung an den adpA-Promotor
- AfsA produziert den A-Faktor in einer Wachstums-abhäng. Weise
- nach Erreichen der Schwellenwertkonzentration bindet der A-Faktor an ArpA
- Dissoziation (Zerfall) des DNA-gebundenen ArpA
- Bindung der RNA-Polymerase
- Transkription des Transkriptionsaktivators adpA
- Transkription von Targetgenen

-regulierte Phänotypen:
Sporulation, Streptomycin-, Polyketide-, Grixazone-Produktion, Streptomycin-Resistenz

• - aphD, kodiert die Hauptresistenz für Streptomycin und steht unter der Kontrolle vom adpA-abhäng. Promoter
• das hilft rapide um die Selbstresistenz zu erhöhen und um Suizid zu vermeiden bevor es zur Induktion der Streptomycin-Biosynthese kommt

• ein typisches TCS (2KS) ist aus einer Sensor (Histidin)-Kinase (HK), die fähig ist Autophosphorylation als Antwort auf Umweltsignale durchzuführen, und einem Response Regulator (RR) zusammengesetzt
• HK, welches an einem konservierten Histidin-Rest phosphoryliert ist, transportiert die Phosphorylgruppe zu der Asparaginsäure auf dem RR
• der Phosphorylationsstatus vom RR in der Zelle ist entscheidend für das Gleichgewicht zwischen Dephosphorylation und Phosphorylation, da dies wiederum die Genexpression (Effektor-Funktion) steuert/ kontrolliert

mögliche Veränderungen:

• Modulation durch:
• Hinzufügen von zusätzlichen Modulen an Domänen
• durch hinzugügen zusätzlicher Connector-Proteine
• die finale Effektor-Funktion hängt von der Phospho-regulierenden Antwort ab, welche sich aus dem Gleichgewicht zwischen Phosphorylation und Dephosphorylation ergibt
• alle drei Reaktionen (Autophosphorylierung, Phosphotransfer und Phosphatase) sind mögliche Kontrollpunkte, wie sie auf Signale von Umwelteinflüssen reagieren können

• EmvZ = Sensor-Kianse
• OmpR = Response-Regulator
• Signal: Membran Druck/Spannung
   
• Zwei untzerschiedliche Porine für die passive Diffussion von z.B Ionen.
• Porin OmpF besitzt einen größeren Porendurchmesser als OmpC -> 10 fach höhere Diffussionsrate -> Selektiver Vorteil bei niedriger Osmolarität -> Abfangen knapper Nährstoffe

niedrige Osmolarität:

• niedrige Expression von OmpC und hohe Expression von OmpF
• niedrige Konzentration von OmpR-P, welches an die ompF-regulierende Region bindet und die Expression von ompF aktiviert

hohe Osmolarität:

• hohe Expression von OmpC und niedrige Expression von OmpF
• die Konzentration von OmpR-P steigt an und
• -> OmpR-P-Moleküle, welche an upstream site F4 gebunden sind interagieren mit OmpR-P-Moleküle die an low affinity sites F2 oder F3 gebunden sind.
• dadurch wird die Expression von ompF unterdrückt
• ompF wird unterdrückt und nicht exprimiert und ompC wird aktiviert
• bei der ompC-Regulatorregion kommt es zur Änderung der Zugänglichkeit der low affinity sites C3 und C2
• -> ermöglicht OmpR-P zu binden -> Aktivierung von ompC

am Beispiel Chemotaxis bei E.coli = Reaktion auf Chemikalien

• reagieren auf Konzentrationsänderung in ihrer Umwelt
• Flagellen Rotation im Uhrzeigersinn nennt sich tumbling;
• Rotation gegen den Uhrzeigersinn ist eine Vorwärtsbewegung
• Ansteigende Lockstoffkonzentration: weniger taumeln, mehr Vorwärtsbewegung (= weniger CheY-P)
• Abfallende Lockstoffkonzentration: mehr Taumeln, (=mehr CheY-P)
• bei Repellentien verhält es sich anders herum

Beispiel Anhand abfallender Lockstoffkonzentration:

• in Antwort auf die abfallende Lockstoffkonzentration, aktivieren die Chemorezeptoren  (MCP) über CheW die Autophosphorylierung von CheA
• das phosphorylierte CheA-P phosphoryliert  CheY oder CheB(Response-Regulator)
• phosphoryliertes CheY-P bindet an den Flagellenmotor und veranlasst einen Wechsel in der Rotationsrichtung von gegen den Uhrzeigersinn nach mit dem Uhrzeigersinn (tumbling)
• CheZ ist eine spezifische Phosphatase die CheY-P kontinuierlich dephosphoryliert und dadurch eine schnelle Signal-Termination erlaubt (tumbling-stop -> Schwimmen)
• CheR methyliert MCL und dient der Adaption der Rezeptoren (damit Änderung des Chemoeffektors wahrgenommen werden können)
• CheB-P demytheliert MCL um die vorherige Sensitivität wieder herzustellen

= Oberflächenassoziierte Gemeinschaften von Mikroorganismen

•  komplexe Aggregation von Mikroorganismen, die sich durch die Produktion einer schützenden und adhäsiven Matrix auszeichnet
• oft charakterisiert durch Adhäsion an Oberflächen, strukturelle Heterogenität, genetische Diversität und komplexe Interaktion/ Kommunikation (QS)

Lebenszyklus:
1. Inhitiale Anheftung individueller Zellen an die Oberfläche
2. Proliferation der Zellen zu Mikrokolonien und Reifung des Biofilms (EPS-Produktion)
3. Ablösung einiger Zellen oder Zellklumpen vom reifen Biofilm und anschließende
Verbreitung

Vorteile des Lebens im Biofilm:

• mechanischer Schutz gegen:
  • Feinde (rankling enemies)
  • Bakteriophagen
  • Licht und UV-Stress
  • Sauerstoff (Anaerobier)
• Gesteigerter Austausch genetischer Informationen
  • Transduktion
  • konjugativer Plasmid-Transfer
• Gesteigerte Resistenz gegen:
  • Schadstoffe
  • Biozide, Antibiotika
• Gesteigerte Nährstoffverfügbarkeit
  • Mutualismus
  • Schutz vor Austrocknung

Resistenz gegen AB durch:

• Nährstofflimitation führt zu Zonen veränderter Aktivität (im Inneren) -> Antibiotika beeinträchtigen oft nur die wachsenden Zellen; dadurch ergibt sich eine erhöhte Resistenz gegen Umweltgifte, Biozide und Antibiotika
•  Zellen im Inneren haben mehr Zeit um eine Stressantwort zu generieren
• außen liegende Zellen dienen als Schutz für die inneren Zellen
• Persistente Zellen können in größeren Mengen vorkommen

• Oberflächenbehandlung z.B. Biozid-haltige Farbe; Farben die viele schwere Metalle enthalten
  •  Beispiel: Einbringen von toxischen Metallen in Nanopartikel -> zu Farben zugeben
    • starke bakterizide Wirkung
    • Wachstum wird dadurch gehemmt
    • die Besiedlung von Bakterien wird verhindert
       
• chemische Reinigung mit Bioziden z.B. Chloride, Ozon, Hydrogenperoxid, Detergenzien
• mechanische Reinigung, oft zusammen mit Biozidbehandlung
• Ultraschall (20-150 kHz)
• Bioelektrizität kombiniert mit Bioziden
• Bakteriophagen
• EPS-Depolymerasen
• Hemmung von Adhäsionen
• Inhibition der Zell-Zell-Kommunikation
• mittels Liposomen eingeschleuste Biozide/AB

P.aeruginose:

• Flegellen
• Typ IV pili
• Cup fimbria
• extrazelluläre eDNA
• Psl Polysaccharide

Attachement:

Cup fimbria: Oberflächen-Attachement, Vermittlung der Adhärenz an Wirtsgewebe durch Ahäsine, Immunevasion durch Antigen-Abschirmung

(2 Komponentensystem, welches die Expression von Extrazellulären Anhängen kontrolliert )

Motalität:

Typ IV Pili/ Flagellen: Bewegung entlang der Oberfläche

Typ IV Pili: Ermöglichen den motilen Bakterien die Stil- und Kappenbildung

reguliert durch: PilRS TCS, Chemotaxis, AlgR, FimS TCS und c-di-GMP

Reifung:

Bildung der Matrix: aus Lectin, eDNA, Proteinen (z.B CdrA) und Exopolysaccharide

• Alginat bei mucoiden(schleimigen) Stämmen
  reguliert durch 2KS FimS/AlgR und KinB/AlgB
   
• Pel Polysaccharide: Glucose-reich, Schnittstelle zwischen Biofilm und Luft
• Psl Polysaccharide: Mannose-reich: Vermittelt-Zell-Oberflächen- und Zell-Zell-Interaktionen reguliert durch c-di-GMP und Sensor Kinase-Antwort Regulator Hybride RetS (Inhibitor) und LadS (Stimulator)
   
• CdrA: Eventuell Verknüpfung der Psl-Polymere und /oder Anbindung der Psl an die P.aeruginosa-Zellwand
  reguliert durch c-di-GMP

nach Anheftung an Oberfläche -> an Ort verbleiben oder Bewegung entlang der Oberfläche (mittels Typ IV pili oder Flagellen)

gleichen Stelle oder bewegt sich entlang der Oberfläche mittels Typ IV Pili oder
Flagellen
- Typ IV Pili: sind an den Zellpolen lokalisiert und an zuckenden Bewegungen beteiligt,
sie steuern zu einer pilzähnlichen Struktur bei, wodurch sie den motilen Ba

Gram-positiv:

• Cytoplasmatische/innere Membran
• dicke Peptidoglycan-Schicht mit Teichonsäure (Murein-Sacculus)
  • 1,4 ß-glycosidisch verknüpfte N-Acetylglucosamin und N-Acetylmuraminsäure - Ketten
  • Quervernetzung der benachbarten Ketten durch Oligopeptide

Gram-negativ:

• innere/cytoplasmatische Membran
• Periplasma (MOD)
• dünne Peptidoglycan-Schicht
• äußere Membran mit LPS (LPS aus inner core, outer core und O-antigen-repeat)

= chemische oder genetische Beeinträchtigung von der Zusammensetzung, Aufrechterhaltung oder
Funktion der Zellmembran und –wand

- drei wesentliche Auslöser:

• Antibiotika
• Kathionische antimikrobielle Peptide
• Sekretorischer Stress

Regulationsmechanismus 1)

durch ECF-Sigmafactoren

• Abwesehnheit des Stimuli (Stress) -> Sigmafaktor an Antisigmafaktor gebunden und dadurch inaktiv gehalten
• bei Stimulus -> Bindung zwischen Sigmafaktor und Antisigmafaktor wird unterbrochen
• -> Sigmafaktor wird frei und beindet an RNA-Polymerase -> Transkription der Target-Gene
   
• Beispiel: E.coli (gram-)
  • normale Wachstumsbedingungen: normale Faltung und Lokalisation der Hüllproteine
    -> Negativregulatoren RseA (Antisigmafaktor) und RseB (Periplasmatische Protein) binlden einen Komplex und SigmaE ist an RseA gebunden
  • bei Stress: RseB wird von RseA durch falsch gefaltete Proteine gelöst
    -> sigmaE löst und bidet an RNA-Polymerase
    -> Target-Gene werden transkribiert (Protease, Folding Factors...)

2. Mechanismus:

durch Zweikomponentensysteme

• bei Stress: His-Autophosphorylierung eines Monomers des Homodimers Histidinkinase (HK)
• HK-P phosphoryliert Aspartat in der Phosphoakzeptordomäne des Antwortregulators (RR)
  -> Konformationsänderung des RR und Aktivierung
• Transkription der Target-Gene
   
• Beispiel: CpxRA TCS
  • normale Bedingungen: CpxP bindet an CpxA und hindert CpxA (HK) an der Autophosphorylierung
  • bei fehlfaltung der Hüllproteine oder Pilus-Assembly -> Freisetzung von CpxP und Autophosphorylierung von CpxA
  • CpxA-P phosphoryliert CpxR (RR)
  • -> Transkription der Target-Gene (Protease, Folding Factors,...)

RIP-Proteasen = Proteasen zur regulierten Intermembran Proteolyse

Zum Beispiel: RseP-Protease

Funktion von RIP-Proteasen:

- Proteolytische Kasskade zur Regulation von Genen, welche einem Stress auf die Zellwand entgegenwirken

- Stresssignal löst  den regulierten intermembranen proteolytischen (RIP) Abbau eines transmembranen regulatorischen Proteins (Antisigmafaktor)aus -> führt zur Freisetzung des alternatifen Sigmafaktors und damit zur Transkription der Gene.

Beispiel: E.coli

gestörte Proteinfaltung/Stres: DegS (S1-Protease, periplasmatisch) -> Abbau von RseA (Antisigmafaktor) durch spaltung der periplasmatsichen Dömäne, so dass Substrat für die die anschließende site-2- Spaltung von RseA durch RseP (S2-RIP-Protease, intermembran) und ClpXP (cytoplasmic protease) vorhanden ist.

diese Kasskade führt dann zur Freisetzung von SigmaE

Beispiel: B.subtilis

PrsW = S1-Protease

RasP = S2-Protease

RsiW = Antisigmafaktor -> wird porteolytisch durch Proteasen abgebaut -> Freisetzung von SigmaW

Fimbriae: P.gingivalis
Type I pili: Escherichia coli
Type IV pili: Neisseria gonorrhoe

Typ I Pili:

• durch pap-Gencluster kodiert
• Chaperon/Usher-vermittelte Pilus Biogenese
  • einzelnen Komponeneten des Pilus werden von cytoplasma ins periplasma durch Typ II Secretions-System transportiert (SecYEG translocation)
  • PapD stabilisiert die Unterinheiten (in Abwesenheit von PapD würden die UE abgebaut werden), katalysiert die ihre Faltung und transportiert diese zu PapC (Usher) an die äußere Membran
  • Zusammenbau und Translokation auf die Zelloberfläche durch PapC
  • dort wird dann zuerst der Pillus -Spitze (Tip) zusammen gebaut und anschliesend wächst der Pillus von der Basis ausgehend weiter (via Donor-strand Complementation)
  • Verankerung an äußerer Membran (an Usher)?

Typ IV Pilus:

• werden an innerer/cytoplasmatischen Membran gebildet und danach durch die äußere Membran (durch PilQ = Secretin ähnliche Pore ) extrudiert
• aus Pilin-UE gebildet (Prepilin wird durch PilD prozessiert)
• wird mittels PilG und den ATPasen PilF/PilT assembliert/deassembliert
• PilC ist ein Adhäsin an der Spitze des pillus (Stabilisiert diesen)
• Verankerung an innerer Membran (PilGFT)?

Autotransporter

• Autotransporter (= Polyprotein) wird über Sec ins Cytoplasma transportiert

• Leader-Sequenz spaltet mit SPase und lässt reifes Polyprotein ins Periplasm frei

• C-terminale β-barrel-Pore exportiert N-terminale Domäne, diese wird translatiert und autoproteolysiert

• es kommt zur Spaltung an der N-terminalen Domäne und zur Freilassung ins Medium

• Verankerung an äußerer Membran (ß-Barrel)?

ist QS- und Zweikomponenetensystem

• aus zwei differgent transkribierten Einheiten: RNA II und RNA III
  • RNA II beinhaltet die Gene argB, argD, argC, und argA
• -arg wir bei Einsetzen der Stationären Phase hochreguliert
• - arg spielt eine wichtige Rolle beim Atachment/Detachment-Prozess und damit der Ausbreitung
• - coding for the peptide delta-toxin (RNA III)

durch arg regulierte Virulenzfaktoren:

• Superantigene (z.B Enterotoxin B, C, D,....)
• Cytotoxine
• Enzyme (Proteasen, Lipasen)
• Oberlächenproteine (Adhäsine, Protein A)

Regulation:

• ArgB (membranständiges Enzym) ist zuständig für die Reifung und den erxport des Autoinducers.
• ArgA und ArgC bilden das Zweikomponenetensystem.
• Autoinducer bindet an ArgC(Sensorkinase) -> His-Autophosphorylierung von ArgC
• ArgC-P führt zur Asp-Phosphorylierung von ArgA (RR)
• Hochregulation der Target-Gene ( RNA II und RNA III)

• Superantigens or type I toxins
• Membrane-disrupting toxins or type II toxins
• A-B toxins or type III toxins
  • Pseudomonas exotoxin A
  • Diphtheria toxin
  • Cholera toxin
  • Shiga toxin

Beispiel:

Diphtheriatoxin

• Ziel der enzymatischen Aktivität des Diphtherietoxin A ist der Elongationsfaktor EF-2, der die Translation bei der Proteinsynthese von Eukaryoten katalysiert
• EF-2 enthält Diphthamid (Aminosäurerest )
• das A-Fragment des Toxins katalysiert die kovalente Modifikation dieses Diphthamids
• dabei wird ein ADP-Ribosylrest aus NAD + unter Abspaltung von Nicotinamid auf das Diphthamid übertragen, auch ADP-Ribosylierung genannt
• dadurch hemmt das Diphtherietoxin die Fähigkeit des EF-2, die Translation der wachsenden Polypeptidkette auszuführen -> Proteinsythese gehemmt

• auf Haut und Epithelien, z.B. Darmepithel,
• Schutz vor eindringenden Bakterien durch ihre positive Ladung
• da Bakterienhülle vorwiegend aus anionischen Bestandteilen (Interaktion durch CAMPs möglich)
   

Bakterien schützen sich durch:

• Schutz  gegen CAMPs durch die Reduzierung der negativen Nettoladung der Zellumhüllung -> Abstoßen von CAMPs
• Heraustreiben von CAMP durch Efflux-Pumpen
• veränderter Membranfluidität
• Spaltung von CAMP durch Proteasen