Molekulare Physiologie 2

Sec-abhängiger Transport:

• meisten der aus dem Cytosol der Bakterienzelle zu transportierenden Proteine werden über einen Sec-abhängigen Proteinexportapparat transportiert.
• ATPabhängige Translokationsweg
• Proteine werden in einem entfalteten Zustand durch die Cytoplasmamembran translokiert.
• Neu synthetisierte Präkursoren werden entweder schon während der Translation (cotranslational) oder kurz danach (posttranslational) durch sogenannte Targetingfaktoren gebunden
   
• Die Tranlokations- ATPase SecA vermittelt unter Verbrauch von ATP die Translokation dieser Peptide durch die Translokationspore, die von den membranintegrierten Proteinen SecY, SecE und SecG gebildet wird.
• Ein heterotrimerer Komplex, der aus SecD, SecF und YajC gebildet wird und mit der Translokationspore assoziiert ist, stimuliert die Proteintranslokation.
• Noch während oder kurz nach der Translokation erfolgt die Abspaltung des Signalpeptides durch Signalpeptidasen

(Im Gegensatz zu E. coli besitzt B. subtilis kein zu SecB homologes Protein. Es wurde mit CsaA ein neues Chaperon identifiziert, dem eine exportspezifische Aktivität zugeschrieben werden kann.)

• Transport von Lipoproteinen

Der Transport erfolgt über den Sec-anhängigen Transportweg von der inner membran zur outer membran, mit Hilfe des ABC-Transporter Lol-Systems.

Lipidmodifikation des Precourser-Lipoproteins nach dem Sec-anhänigen Transport.

Tat-abhängiger Transport:

• ursprünglich nur für Chloroplasten beschriebenen
• Proteine werden in gefaltetem Zustand transportiert
• zu exportierende Proteine besitzen ein Signalpeptid mit einem hochkonservierten Doppelarginin-Sequenzmotiv (wird deshalb auch als Tat-abhängige Translokation (von „twin arginine translocation“) bezeichnet.)
• vom pH-Gradient der Cytoplasmamembran abhängige Exportweg
• unabhängig von ATP, ist abhängig vom pH-Gradient an der cytosolischen Membran und
• besitzt keine bekannten löslichen Komponenten, welche den Proteintransport vermitteln.

Allgemein besteht das System aus den Komponenten:

• TatA,TatB ,TatC, TatE
   
• wobei A,B und E membranassoziiert sind
• diese lagern sich also erst nach Erkennung des Signalpeptides zu einer aktiven Pore zusammen.
• (In den Genomen Gram-positiver Bacillus-Stämme multiple TatA- und TatC-Proteine gefunden.)
   
• gefaltete Proteine (meist mit Co-Faktor) werden über ein Signalpeptid an den Tat-Komplex gebunden und über die Membran transportiert
• Doppelarginin-tragende Precursor (Pre-RR) bindet an den TatA/TatC-Komplex
• TatA bildet die Pore; TatA kann verschieden groß sein und erlaubt somit den Transport von sehr verschieden großen Substraten
• TatB und TatC dienen der Erkennung
• nach dem Transport wird das Signalpeptid durch eine Signalpeptidase abgespalten

• Verankerung der Proteine in der Membran nach der Sekretion

1. Das sekretierte Protein besitzt 4 hydrophobe Segmente (thick lines) und wurde vermutlich posttranslational exportiert.

2. Initiale Interaktion zwischen dem N-Terminus mit der Signalsequenz und der Membran führt zur Öffnung des Translokationstunnels und zur Translokation

3. Das Eintreten des zweiten hydrophoben Segmentes in den Tunnel provoziert, dass der Tunnel sich seitlich öffnet und das der erste hydrophobe Teil in die Lipidschicht diffundiert

4. Der Zyklus wird re-initiiert durch das dritte hydrophobe Segment usw. bis die finale Topology erreicht wurde (+ Regionen beeinhalten wahrscheinlich ein paar positive Rest-Ketten)
    

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• Verankerungen von Proteinen in der Zellwand (Bsp. Staphylococcus)

1. Export. Precursor-Protein mit N-terminalen Signalpeptid bindet an den Sec-Kanal, wodurch das Signalpeptid abgelöst wird

2. (Speicherung)Retention. Das C-terminale Sortierungs-Signal behält das Polypeptid innerhalb des Sec-pathways.

3. Spaltung. Sortase spaltet zwischen Threonin und Glyzin im LPXTG motif, daraus resultiert die Bildung eines Thioester-Enzym-Intermediat

4. Linkage. Nucleophile Angriff auf die freie Aminogruppe des Lipid II an der Thioester-Bindung acyl-Enzym-Intermediat wird aufgelöst Synthese der Amino-Bindung zwischen Oberflächenproteinen und der Penta-Glycin cross-bridge Regenerierung des aktiven Zentrums Sulphydryl

5. Zellwand-Integrierung. Lipid-linked Oberflächen-Proteine werden als erstes in die Zellwand eingebracht mittels Transglycosylation wodurch reifes Murein- Tetrapeptid entsteht, es kommt zur Pentaglycinbrückenverankerung

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• Typ I (ABC-Transporter)

• Typ II (Typ 4 Pili)

• Typ III (VIRULENZFAKTOR)

• Typ IV (VIRUELNZFAKTOR)

• Typ V (Autotransporter)

• Typ VI (Chaperone)

Typ 1, 3 und 4 sekretieren in einer Etappe. Typ 2 und 5 sekretieren in 2 Etappen mittel Sec/Tat-pathways.

ABC-Transporter (Bsp. Hämolysin HlyA)

• HlyA interagiert mit dem ABC-Transporter-Komplex

• infolgedessen wird HlyA in Einzelschritten über beide Membranen während einer Reaktion translatiert, dabei wird ATP verbraucht

• es kommt zur Hydrolyse und zu einer Wechselwirkung von HlyD mit TolC

Typ IV Pilus

• der Pilus wird durch die Interaktion von Pseudopilinen und Exoproteinen im Cytoplasma verlängert

Typ III (VIRULENZ)

• ringartige Strukturen in bakterieller Membranen, dienen der Stabilisierung

• bilden längliche extrazelluläre Struktur (Nadel) aus

• kann in eukaryotische Membranen eindringen

• benötigt Energie aus ATP-Hydrolyse für die Translokation von bakteriellen Proteinen (T3SS Effektoren) in den Wirt

Typ IV (VIRULENZ)

• Pilus für den DNA-Transfer von Bakterienzelle in die Wirtszellen

• besteht aus VirB2 und ist befestigt mit VirB5, z.B. bei Agrobacterium tumefaciens

Autotransporter

• Autotransporter (= Polyprotein) wird über Sec ins Cytoplasma transportiert

• Leader-Sequenz spaltet mit SPase und lässt reifes Polyprotein ins Periplasm frei

• C-terminale β-barrel-Pore exportiert N-terminale Domäne, diese wird translatiert und autoproteolysiert

• es kommt zur Spaltung an der N-terminalen Domäne und zur Freilassung ins Medium

Definition

• als oxidativen Stress bezeichnet man eine Stoffwechsellage, bei der eine das physiologische Ausmaß überschreitende Menge reaktiver Sauerstoffverbindungen (ROS - reactive oxygen species) gebildet wird, bzw. vorhanden ist

• es ist die unvermittelte Konsequenz des aeroben Lebens alle aeroben Organismen haben Schutzmechanismen zur Reparatur von Schäden und zur Inaktivierung von ROS (und auch RES) entwickelt

• ROS können in Eukaryoten auch als second-messenger wirken

Entstehung

• wird durch exogene Ursachen verursacht: Tabletten (Medikamente), Rauchen, physischer und psychischer Stress, Ozon, ungesundes Essen, Umweltverschmutzungen etc.

• ist beteiligt am: altern, Diabetes, Neurodegenerative Erkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Immunabwehr

• Entstehung:

  • Durch stufenweise 1-Elektronenübertragung auf O2 („Fenton“-Reaktion)

  • in der Atmungskette entstehen Superoxidanion und H2O2

  • Autooxidation von Flavoproteinen (Superoxidanion und H2O2)

  • Einwirkungen auf bakterielle Zellen:

  • Milchsäurebakterien, Wechsel zwischen Oxischen/anoxische Bedingungen, Photochemische Einwirkungen, Makrophagen, diese nutzen ROS als Abwehr vor Pathogenen, da sie resistent gegen ROS sin

Auswirkungen

• schädigen Kohlenhydrate

• Membranschäden

• Inaktivierung des Fe-S-Clusters

• irreversiblen DNA-Schäden (Punktmutationen; Fehlbasenpaarung durch Oxidation) Autooxidation Flavoproteine O2 kann oxidiertes Eisen-Schwefel dehydrolieren Eisen wird im Cytosol freigesetzt Eisen katalysiert einen zufälligen e-Transfer auf H2O2 ruft das HO. -Radikal (Hydroxy-Rad.) hervor und greift die DNA an Basen werden verändert (Guanin 8-oxo-Guanin) Fehlpaarungen (OG-A), Punktmutationen

• Proteinschäden führen beispielsweise zu Cysteinmodifikationen

• Superoxiddismutase (Sod)

• Katalase (Kat)

• Glutathion-Peroxidase (Gpx)

• Thiol-Peroxidas (Tpx)

• Peroxiredoxin (OhrA, Prx) bei Prokayoten und bei Eukaryoten

• Ruberythrine (Rbr) Reduktion von H2O2 (anaerobe Clostridien)

• Alkylhydroperoxid-Reduktase-System (AhpCF) Reduktion von H2O2