Molekulare Physiologie 2

Tat-abhängiger Transport:

• ursprünglich nur für Chloroplasten beschriebenen
• Proteine werden in gefaltetem Zustand transportiert
• zu exportierende Proteine besitzen ein Signalpeptid mit einem hochkonservierten Doppelarginin-Sequenzmotiv (wird deshalb auch als Tat-abhängige Translokation (von „twin arginine translocation“) bezeichnet.)
• vom pH-Gradient der Cytoplasmamembran abhängige Exportweg
• unabhängig von ATP, ist abhängig vom pH-Gradient an der cytosolischen Membran und
• besitzt keine bekannten löslichen Komponenten, welche den Proteintransport vermitteln.

Allgemein besteht das System aus den Komponenten:

• TatA,TatB ,TatC, TatE
   
• wobei A,B und E membranassoziiert sind
• diese lagern sich also erst nach Erkennung des Signalpeptides zu einer aktiven Pore zusammen.
• (In den Genomen Gram-positiver Bacillus-Stämme multiple TatA- und TatC-Proteine gefunden.)
   
• gefaltete Proteine (meist mit Co-Faktor) werden über ein Signalpeptid an den Tat-Komplex gebunden und über die Membran transportiert
• Doppelarginin-tragende Precursor (Pre-RR) bindet an den TatA/TatC-Komplex
• TatA bildet die Pore; TatA kann verschieden groß sein und erlaubt somit den Transport von sehr verschieden großen Substraten
• TatB und TatC dienen der Erkennung
• nach dem Transport wird das Signalpeptid durch eine Signalpeptidase abgespalten

• Verankerung der Proteine in der Membran nach der Sekretion

1. Das sekretierte Protein besitzt 4 hydrophobe Segmente (thick lines) und wurde vermutlich posttranslational exportiert.

2. Initiale Interaktion zwischen dem N-Terminus mit der Signalsequenz und der Membran führt zur Öffnung des Translokationstunnels und zur Translokation

3. Das Eintreten des zweiten hydrophoben Segmentes in den Tunnel provoziert, dass der Tunnel sich seitlich öffnet und das der erste hydrophobe Teil in die Lipidschicht diffundiert

4. Der Zyklus wird re-initiiert durch das dritte hydrophobe Segment usw. bis die finale Topology erreicht wurde (+ Regionen beeinhalten wahrscheinlich ein paar positive Rest-Ketten)
    

.

• Verankerungen von Proteinen in der Zellwand (Bsp. Staphylococcus)

1. Export. Precursor-Protein mit N-terminalen Signalpeptid bindet an den Sec-Kanal, wodurch das Signalpeptid abgelöst wird

2. (Speicherung)Retention. Das C-terminale Sortierungs-Signal behält das Polypeptid innerhalb des Sec-pathways.

3. Spaltung. Sortase spaltet zwischen Threonin und Glyzin im LPXTG motif, daraus resultiert die Bildung eines Thioester-Enzym-Intermediat

4. Linkage. Nucleophile Angriff auf die freie Aminogruppe des Lipid II an der Thioester-Bindung acyl-Enzym-Intermediat wird aufgelöst Synthese der Amino-Bindung zwischen Oberflächenproteinen und der Penta-Glycin cross-bridge Regenerierung des aktiven Zentrums Sulphydryl

5. Zellwand-Integrierung. Lipid-linked Oberflächen-Proteine werden als erstes in die Zellwand eingebracht mittels Transglycosylation wodurch reifes Murein- Tetrapeptid entsteht, es kommt zur Pentaglycinbrückenverankerung

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• Typ I (ABC-Transporter)

• Typ II (Typ 4 Pili)

• Typ III (VIRULENZFAKTOR)

• Typ IV (VIRUELNZFAKTOR)

• Typ V (Autotransporter)

• Typ VI (Chaperone)

Typ 1, 3 und 4 sekretieren in einer Etappe. Typ 2 und 5 sekretieren in 2 Etappen mittel Sec/Tat-pathways.

ABC-Transporter (Bsp. Hämolysin HlyA)

• HlyA interagiert mit dem ABC-Transporter-Komplex

• infolgedessen wird HlyA in Einzelschritten über beide Membranen während einer Reaktion translatiert, dabei wird ATP verbraucht

• es kommt zur Hydrolyse und zu einer Wechselwirkung von HlyD mit TolC

Typ IV Pilus

• der Pilus wird durch die Interaktion von Pseudopilinen und Exoproteinen im Cytoplasma verlängert

Typ III (VIRULENZ)

• ringartige Strukturen in bakterieller Membranen, dienen der Stabilisierung

• bilden längliche extrazelluläre Struktur (Nadel) aus

• kann in eukaryotische Membranen eindringen

• benötigt Energie aus ATP-Hydrolyse für die Translokation von bakteriellen Proteinen (T3SS Effektoren) in den Wirt

Typ IV (VIRULENZ)

• Pilus für den DNA-Transfer von Bakterienzelle in die Wirtszellen

• besteht aus VirB2 und ist befestigt mit VirB5, z.B. bei Agrobacterium tumefaciens

Autotransporter

• Autotransporter (= Polyprotein) wird über Sec ins Cytoplasma transportiert

• Leader-Sequenz spaltet mit SPase und lässt reifes Polyprotein ins Periplasm frei

• C-terminale β-barrel-Pore exportiert N-terminale Domäne, diese wird translatiert und autoproteolysiert

• es kommt zur Spaltung an der N-terminalen Domäne und zur Freilassung ins Medium

Definition

• als oxidativen Stress bezeichnet man eine Stoffwechsellage, bei der eine das physiologische Ausmaß überschreitende Menge reaktiver Sauerstoffverbindungen (ROS - reactive oxygen species) gebildet wird, bzw. vorhanden ist

• es ist die unvermittelte Konsequenz des aeroben Lebens alle aeroben Organismen haben Schutzmechanismen zur Reparatur von Schäden und zur Inaktivierung von ROS (und auch RES) entwickelt

• ROS können in Eukaryoten auch als second-messenger wirken

Entstehung

• wird durch exogene Ursachen verursacht: Tabletten (Medikamente), Rauchen, physischer und psychischer Stress, Ozon, ungesundes Essen, Umweltverschmutzungen etc.

• ist beteiligt am: altern, Diabetes, Neurodegenerative Erkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Immunabwehr

• Entstehung:

  • Durch stufenweise 1-Elektronenübertragung auf O2 („Fenton“-Reaktion)

  • in der Atmungskette entstehen Superoxidanion und H2O2

  • Autooxidation von Flavoproteinen (Superoxidanion und H2O2)

  • Einwirkungen auf bakterielle Zellen:

  • Milchsäurebakterien, Wechsel zwischen Oxischen/anoxische Bedingungen, Photochemische Einwirkungen, Makrophagen, diese nutzen ROS als Abwehr vor Pathogenen, da sie resistent gegen ROS sin

Auswirkungen

• schädigen Kohlenhydrate

• Membranschäden

• Inaktivierung des Fe-S-Clusters

• irreversiblen DNA-Schäden (Punktmutationen; Fehlbasenpaarung durch Oxidation) Autooxidation Flavoproteine O2 kann oxidiertes Eisen-Schwefel dehydrolieren Eisen wird im Cytosol freigesetzt Eisen katalysiert einen zufälligen e-Transfer auf H2O2 ruft das HO. -Radikal (Hydroxy-Rad.) hervor und greift die DNA an Basen werden verändert (Guanin 8-oxo-Guanin) Fehlpaarungen (OG-A), Punktmutationen

• Proteinschäden führen beispielsweise zu Cysteinmodifikationen

• Superoxiddismutase (Sod)

• Katalase (Kat)

• Glutathion-Peroxidase (Gpx)

• Thiol-Peroxidas (Tpx)

• Peroxiredoxin (OhrA, Prx) bei Prokayoten und bei Eukaryoten

• Ruberythrine (Rbr) Reduktion von H2O2 (anaerobe Clostridien)

• Alkylhydroperoxid-Reduktase-System (AhpCF) Reduktion von H2O2

Trx/Grx-Systeme
(katalysieren Thiol bzw. Disulfid-Austauschreaktionen, um den reduzierten Zustand des Cytoplasmas beizubehalten)

Thiol-Redoxpuffer:

• Glutathion GHS

• Bacillithiol (BSH)

• Mycothiol (MSH)

Definition

• reaktive elektrophile Spezies; „e--liebend“; Redox-aktive Verbindungen mit elektronendefizienten Zentren

• Oxidation von Aminosäuren, Lipiden und Kohlenhydraten durch ROS führt zu „Reactive electrophile species (RES)“

Beispiele

• Methylglyoxal (MG) (= 2-Oxopropanol)

• Formaldehyde

• Diamide

Entstehung

• RES haben elektronendefiziente Zentren und führen zur irreversiblen Thiol-(S)-Alkylierung (Michael-Addukt-Bildung) von Cysteinen

Beseitigung durch Bakterien

• Chinon-Reduktasen und Thiol-abhängige Dioxygenasen

• Azoreduktasen

• Glyoxalase I und II

• Formaldehyd Reduktase (Fdh)

der reduzierte Redoxzustand des Cytoplasmas wird durch das TrxAB und Grx/ GSH/ Gor-System und Thiol-Redoxpuffer (GSH, MSH, BSH) aufrechterhalten

• = Thiol-basierter Sensor mit Zink-Redoxzentren

• Hsp33 wird durch ROS (H2O2 und HOCl) als redox-aktives Chaperon aktiviert

• Hsp33 hat 4 redox-sensitive Cysteine, die unter reduzierten Bedingungen Zn2+ binden

• die Oxidation von Hsp33 findet durch H2O2 statt; in Gegenwart von Hitze oder Oxidation von HOCl Dimerisierung und Aktivierung der Chaperonfunktion durch Exposition der Substratbindestelle (wobei Zn2+ freigesetzt wird)

• oxidiertes und aktives Hsp33 verhindert die Aggregation (= Zusammenlagern) von oxidativ geschädigten und falsch gefalteten Proteinen

S-Thiolierungen: Redoxpuffer werden oxidiert, um die Reduktion der Proteine aufrecht zu erhalten

S-Glutathionylierung in E. coli und Eukaryoten (gr-):

Funktionen:

• Co-Faktor für Glyoxalase
• Entgiftungsmittel
• Reduktion von Disulfidbrücken

beseitigt durch:

• Peroxidase und Reduktase
• Glutatredoxin
• Glutathion-Disulfid-Reduktase

S-Bacillithiolierung in Bacillus und Staphylococcus (gr+):

(Brx = Bacilliredoxin; reduziert S-Bacillithiolierte Proteine)

(Bdr = Bacillithiol-Disulfid-Reduktase; reduziert BSSB (ist die ox. Form))

Funktionen:

• entgiftet Antibiotika-Toxine
• bildet Co-Faktor zur Entgiftung von ROS/ RES (Proteinschutz)
• Fosfomycin Detoxifikation

beseitigt durch:

• Bacilliredoxin
• Bacillithiol-Disulfidbrücken-Reduktase

S-Mycothiolierung in Actinomyceten:

(Mrx1 = Mycoredoxin; reduziert S-mycothiolierte Proteine)

(Mtr = Mycothiol-Disulfid-Reduktase; reduziert MSSM (ist die ox. Form))

Funktionen:

• Entgiftung
• Co-Faktor für Aldehyd-DH
• Entgiftung von RON und Formaldehyd

beseitigt durch:

• Mycoredoxin
• Mycothiol-Disulfidbrücke-Reduktase

ArcBA (= Chinon-basierter Sensor für O2)

• Das ArcBA Zweikomponenten-Regulationssystem ist ein globaler Regulator der Genexpression unter mikroaeroben und anaeroben Wachstumsbedingungen.

• In Abwesenheit von O2 wird ArcB an einem Histidin in der Transmitter-Domäne autophosphoryliert und überträgt den P-Rest über eine Kaskade auf den DNA-bindenden Response-Regulator ArcA

• ArcA~P reprimiert die Expression der terminalen Cytochrome o Oxidase, von TCA zyklus enzymen und Dehydrogenasen für das aerobe Wachstum (PDH) und aktiviert die Expression der O2-affineren terminalen Cytochrome d Oxidase

• ArcB detektiert nicht direkt O2, sondern den Redox-Status des Chinon-Pools der Atmungskette; Redox-Sensoren können also auch den Redox-Status des Chinon-Pools der Zelle messen, was zur Inaktivierung durch O2 führt (ArcB)

• die Aktivierung von ArcB erfolgt durch die Reduktion intermolekuarer Disulfidbrücken

FNR (= Regulator of fumarate-nitrate-respiration: Cluster-basierter Sensor)

• Das Fe-S Protein FNR von E. coli ist ein direkter Sensor von O2

• Unter anaeroben Verhältnissen bewirkt FNR die Expression alternativer Elektronenakzeptoren (anaerobe Respiration)

• FNR besteht aus 2 Domänen: einer N-terminalen sensorischen Domäne und einer C-terminalen DNA-Bindedomäne

• Unter anaeroben Bedingungen koordiniert die N-terminale Domäne ein [4Fe-4S] Cluster und bildet einen homodimeren Komplex

• Unter aeroben Bedingungen wird dieses Cluster zunächst in ein [2Fe-2S] Cluster und anschließend in das Apo-Protein überführt

• Dadurch wird FNR unter aeroben Bedingungen inaktiviert

= Cluster-basierter Sensor

• Aconitasen sind Fe-S Proteine, welche die Umwandlung von Citrat in Isocitrat innerhalb des TCA-Zyklus katalysieren

• können aber auch Sensoren für oxidativen Stress uns Eisenmangel sein

• unter Eisenmangel oder oxidativem Stress wird das [4Fe-4S] Cluster zerstört und das Enzym verliert seine katalytische Aktivität

• das resultierende Apo-Protein kann spezifisch an mRNAs binden und so als Post-Transkriptionaler Regulator fungieren; die mRNA-Bindestellen werden als „iron responsiv elements“ (ihres) bezeichnet

• ihres sind sogenannte Stem-Ioop-Strukturen, welche sich durch Rückfaltung palindromer Sequenzen bilden

• die Bindung von Aconitase kann die mRNA stabilisieren oder eine Translation verhindern

• Disulfidbrückenbildungen im Periplasma Proteine mit stabilen Disulfidbindungen in den oxidierten Bereichen

• bei E.coli: ist das Periplamsa der Bereich für die Disuldidbrückenbildung (Dsb)

• viele Proteine benötigen Disulfidbrücken für eine korrekte Faltung

• Disulfidbrückenbindungen sind in unterschiedliche Reaktionswege involviert:

1. Oxidation (DsbA und DsbB)

2. Isomerisation (DsbC, DsbD)

3. Reduktion von Sulfensäuren (DsbG, DsbD); neu beschrieben

4. Reduktion von Methioninsulfoxid (MsrAB-Trx; DsbD); neu beschrieben

• Proteine werden in einer non-reducing SDS-Page in der ersten Dimension aufgetrennt

• die entstandenen Banden werden für die zweite Dimension horizontal auf ein reducing-SDS-Gel gelegen

• Proteine ohne Dsb werden als grade Linie sichtbar (A)

• Proteine die disulfid-verknüpft als Heterodimer (B-S-S-C) vorliegen werden unter der Diagonalen sichtbar (B+C)

• Proteine die disulfid-verknüpft als homodimer (E-S-S-E) vorliegen, werden als einzelne Proteine unter der Diagonale sichtbar (E)

• Proteine die intrazelluläre Dsb (D-SS oder F-SS) besitzen werden als sichtbare Proteinpunkte oberhalb der Diagonalen sichtbar (D+F)

• erst nach oxidativem Stress bilden sich Dsb aus