Molekulare Biotechnologie der Prokaryoten

- DNA-Stabilisierung durch DNA-Bindeproteine (Archeaelle Histone)

•  Histonmenge höher
•  größere hydrophobe Interaktionen
•  Ionenbindungen zu Histonen

- Temperaturstabile Membranlipide

• Dietherlipide

- Hochaktive Chaperone, die die Proteine bei der Faltung unterstützen und stabilisieren

• Qualitätskontrolle
• Erhaltung der Funktionsfähigkeit

- Hitzestabile Enzyme

• kompakter gebaut

1)  Cellulase- Thermotoga neapolitana - Celluloseabbau (optimale Aktivität bei 106°C)

2) Cellulase/ Endoxylanase - Thermatoga thermarum - Bleichung von Papierzellstoff  (o.A 90-100°C)

 [Cellulase oft auch in Waschmitteln statt Chlorbleiche (Ausfasern -> graue Wäsche, Cellulase bauen Fasern ab)]

3) Phytase - Bacillus sp. strain DS11 - Phytatabbau in Tierfutter (o.A. 70°C)

[damit in Tierfutter für Tiere schwer abbaubare Phosphatspeicherstoffe abgebaut werden können]

[termophile Enzyme, damit bei normalen Temp. lange Haltbarkeit]

Enzyme: Lipasen, Cellulasen (Waschmittel, Brotherstellung...)

Metabolite: Antibiotika, Botox, Glutamat, Aminosäuren, Vitamine

Biologicals: Biopharmazeutika: Insulin (Proteinwirkstoff, Ecoli)

Diagnostika: Antikörper

Ein Interdisziplinärer Ansatz biologische Systeme auf molekularer Ebene zu erforschen und die gewonnen Erkenntnisse praktisch anzuwenden

- Mikrobiologie, Biochemie, Genetik, Verfahrenstechnik

Genom = Mamagement

Zellwand = Werkstatt

Polysomen = Fertigungsmaschinen

Granular = Vorratsbehälter

Pore = Transport

- Umweltfreundlicher

- Reinheit der Stoffe - saubere enzymatische Reaktion in eine Richtung

- Spezifität und Selektivität

      - keine Verunreinigung

     - keine Aufwendigen Trennverfahren

- Effizienz und Umweltverträglichkeit

      - nur kostengünstige Ausgangsstoffe (Zucker, Salze, Sauerstoff...)

      - überwiegend bei raumtemperatur

      - Energiesparend und weniger Kosten

      - weniger Abfälle und Nebenprodukte

- neue Behamdnlungsstrategien (z.B. monoklonale Antikörper)

- bessere verfügbarkeit

- vermindertes Infektionsrisiko

- höhere Wirksamkeit und geringere Nebenwirkungen

- umweltverträglichere und wirtschaftliche Produktion

robuste Biokatalysatoren in Industrie von nöten

- hohe/ niedrige temperaturen (hohe Temp.: Waschvorgänge, PCR, Destillationsverfahren)

- hoher/ niedriger pH (hoher pH - Waschmittel -> alkalophile Bakterien-Enzyme)

- hoher Druck

- hoher Salzgehalt
 

Psychrophil: -5 bis 20°C (kein Wachstum oberhalb 25°C)

Psychrotolerant: 10-30°C (Optimum > 15°C)

Thermophil: Temperaturoptimum 50-70°C

Extrem Thermophil: TO 70-85°C

Hyperthermophil: TO bei 85 bis 113°C

Halophile: 10-35% Salz

Acidophile: pH 0,7 - 4

Alkaliphil: pH 8-11

- Taq-Polymerase

• Thermus aquaticus
• aus heißer Quelle im Yellowstone-Nationalpark
• 3`- Überhänge
• keine proof-reading-Aktivität

- Pfu-DNA-Polymerase

• Pyrococcus furiosus
• keine 3'-Überhänge
• mit proof-reading-Aktivität

• Inneres des Proteins

• Interface/Zwischenmantel – Ausbuchtungen, wichtig für katalytische Funktion

• Oberfläche – AS für Substraterkennung und Bindung

für mesophile als auch thermophile Proteine gilt:

• Hydrophpobe Interaktionen = treibende Kraft der Proteinbildung

• Hydrophobe Aminosäureberiche verusrsachen zunächst eine collapsed Struktur, die durch weitere intramolekula bindungskräfte zur nativen Proteinstruktur führen.

• Stabilisierende Wechselwirkungen sind vor allem in den wenig konservierten Bereichen der Proteine zu finden .

Helixstabil.:

Niedrige Frequenz von verzweigten AS (z.B Val, Ile, Thr)

spezifische As am Helixende (z.B. Pro)

Stabilisierende Interaktion im Inneren des geflat. Proteins:

Disulfidbrücken, H-brücken, Hydrophobe Interaktionen, Aromatische Interakt., Ionenbindungen, Verbindung von „loose ends“ (z.B N- und C-Terminus mit eineander verknüpft) an der Proteinoberfläche

Stab. zw. Domänen und Untereinheiten:

Oligomerbildung via z.B Ionenbindungen

Dichtere Packung:

Teilweise verstärkte Hydrophobizität im Kern

Stabile Oberflächenexponierte AS:

Niedriger Level an Oflächen-AS, die Potentiell deaminiert oder oxidativ abgebaut werden können

Psychrophil: Organismen wachsen optimal unter 15°C. Oberstes Temperaturlimit ist 20°C

Psychrotolerante Organismen: tolerieren Temperaturen bis 0°C oder darunter. Optimales Wachstum bei 20 - 25°C. Oberes Temperaturlimit bei 30°C

- Stabilisierung von mRNA-Sekundärstrukturen und dadurch zu einer verringerten Translationseffizienz (Shine-Dalgarno Sequenz kann blockiert sein (nicht einzelsträngig vorliegend)

- Verringerung der Fluidität der Membran

- Erstarrung der Enzymstrukturen → vermidnerte Stoffwechselaktivität

1. durch die Synthese von RNA-Chaperone können RNA-Sekundärstrukturen aufgelöst und so mRNAs für die Translation zugänglich gemacht werden

2. durch Einbau langkettiger, vielfach ungesättigter Fettsäuren kann die Fluidität der Membranstrukturen aufrecht erhalten werden

3. Durch eine erhöhte Flexibilität der Proteinstruktur können kälteangepasste Enzyme psychrophiler Organismen auch noch bei Temperaturen um den Gefrierpunkt effizient arbeiten.

• Frostschutz

• Aktivität der Enzyme muss angepasst sein

• Kältedenaturierung der Proteine muss verhindert werden

• Membranfluidität muss gewährleistet werden

• Flexible helix-Strukturen: hohe Frequenz an verzweigten Aminosäuren (Val Ile, Thr) weniger Arg und Pro, größere Loops an der Oberfl. (ermöglicht verstäkte Interaktion des Enzyms mit Lösungsmittel)

• Weniger stabilisierende Interaktionen im Innern des gefaltenden Proteins: weniger hydrophobe AS (im gegensatz zu thermophilen = hohe hydrophobe AS)

• Aminsäuren: Hoher Level an Gln und Asn, mehr polare AS

• Katalytische Zentren: kein Unterscheid zu mesophilen Enzymen

• Alle Modifikationen führen zu einer weniger starken Kompaktheit der Enzyme???

Backen

• Amylasen
• langsamere Alterung der Brotkruste

Fruchtsaftproduktion

• Pectinasen, Amylasen, Cellulasen
• Bessere Qualität/Aroma (Auflösen, Fruchtzellwand)
• leichter zu inaktivieren als thermophile Enzyme (weniger lange Erhitzen)

Milchproduktion

• beta-Galaktosidase
• Beseitigung von Lactose
• bei Kühlschranktemp.

Konservierung

• Muramidasen, Chitinasen*, Glucanasen*  Lysozym, Glucoseoxidasen
• Verhinderung von Wachstum störender MO, Zellaufschluss

*Pilzzellaufschluss

- Bildung von Inclusion bodies

- nicht löslich, falsche Konformation, Aggregatbildung

- Clp-Proteasen bauen Aggregate ab

Lösung:

• Expressionssysteme mit E.coli: niedrig Temp. Expressionssysteme
  (mehr Zeit für Proteinfaltungsprozesse durch Verlangsamung der Überexpressionsgeschwindigkeit)

•  Raumtemperatur = Niedrigtemperatur für E.coli, Coüberexpression von Lipase und analogen Chaperonen (aus kälteangepassten Organismus?) GroEL/GroES >> führt zu schnellerer Proteinfaltung der Lipase >> E.coli zeigte veränderte (verbesserte) Wachstumserscheidungen (ähnlich einem kälteangepassten Organismus)

• Proteine können löslich produziert werden obwohl sie egtl unlöslich sind bei niedrigen Temperaturen (Raumtemperatur)

Peudoalteromonas haloplanktis

• gram negativ, aerob

• extrem schnelles Wachstum bei 0-29 Grad, Optimum 16 Grad ( wie E.coli bei 30 Grad)

• marines Bakterium

• begeiselt

• leicht zu kultivieren

• genetisch zugänglich, Genomsequenz bekannt

• Proteine werden hergestellt und können auch ins Medium abgegeben werden

(thermoacidophiles Archae-Bakterium)

• an zwei Extreme angepasst: wächst im pH Bereich um 0,5 und bei Temperaturen bis zu 65 Grad

• pH Bereich in der Zelle leicht sauer (4,6)

• lebt aerob auf organischen Substanzen

• technisch interessante Enzyme!

• Bakterium, mit einem der kleinsten Genome (1,54 Mb)

• nicht parasitärer heterotropher MO (mit ungewöhnlich hoher Informationsdichte, 92%) >> codierende Sequenzen liegen nah beieinader >> Stoffwechselphysiologie sehr abgegrenzt

• im Stammbaum der Archaen bei Acidophilen

• Glykolyse, TCC, Atmungskette und sehr viele Transporter

• Biotechnologische Anwendung:

• Protein- oder Polysaccahrid abbauende Enzyme in der Getränkeindustrie
  (z.B. Glucoamylase, ein Stärke abbauendes Enzym, bei pH Optimum 2 arbeitend und zude beim hohen Temperaturen stabil)

• Fett-spaltende Enzyme

Problem: viele Erze nur noch in geringen Mengen verfügbar

• Lösung: Einsatz von acidophilen chemolithotrophen Bakterien, um auch minderwertige Erze nutzen zu können (in Lösung bringen)

• Bakterielles Leaching: Gewinnung von Schwermetallen(Cu, Zi, Co, Ni, Au...) aus ihren Erzen durch Umwandlung von unlöslichen Erzmineralien zu wasserlöslichen Salzen durch MO

Bsp: Pyrit (FeS2)

• >> Redoxzyklus des Eisens genutzt zur Gewinnung des Reinmetalles >> Die Hauptformen des Eisens in der Natur sind die zwei- bzw. dreiwertigen Kationen des Metalls

• Acidithiobacillus ferrooxidans >> Oxidation von Fe2+ zu Fe3+ Ionen >> Bakterien gewinnen dadurch Energie für ATP Gewinnung und die Herstellung von Reduktionäquivalenten

• die unlöslichen Metallsulfide werden durch eisenoxidierende Baktrien in lösliche Sulfate umgewandelt und damit in Lösung gebracht >> Ansäuerung des Mediums dadurch sicher gestellt

Bsp: Auslaugung von Kupfer

• Kupfer wird überwiegend aus Chalkopyrit haltigen Erzen, die auch Pyrit enthatlten, gelaugt >> dabei entsteht Schwefelsäure und das leicht lösliche blaue gefärbte Kupfersulfat

• Zementation: Die in der Lösung vorliegenden zweiwertigen Cu.Ionen, werden mit elementaren Eisen(schrott) zu elementarem Kupfer reduziert und ausgefällt

• Verbeitung basophiler Bakterien: Soda Lake, Mojave River

• E.coli -> nicht Halophil -> Zellen würden autrocknen, aufbrechen, Enzyme denaturieren -> inaktiviert

• Halotolernat: Staphylococcus aureus

• Halophil: Vibrio fischeri (Maximale Wachstumsrate bei 3% Salzgehalt)

• Extrem Halophil: Halobacterium salinarum (Maximum bei ca. 30 % Salzgehalt)

Lebensräume (z.B)

• Großer Salzsee (Utah)

• in Kalifornien gelegene Saline

• Natronsee in Ägypten

• spanische Salline

1. Leuconostoc mesenteroides zur Sauerkrautherstellung (2,5% Salz)

2. Lactobacillus lactis zur Herstellung von Sojasoße (12-27% Salz)

• bilden hohe Konzentrationen an osmoprotektiven Substanzen (compatible solutes):

• z.B. Ectoin (1,4,5,6-Tetrahydro-2-Methyl-4-Pyrimidincarboxylat, von Archeabakterien produziert). Glycinbetain, [Dimethylsufoniopropionat <- häufig vorkommende compatible solutes in Meeresalgen, wichtigste Schwefelquelle in marinen Ökosystemen)] Trehalose, Sucrose ( [2] Kohlenhydrate) und Glyzerin, Mannitol ( [2]Alokohol)

• Glycerin = wichtigster Grundstoff in Kosmetik und Pharmaindustrie, Herstellung von Sprengstoffen (Daunaliella salina bei 3M Salzkonzentration Produktion von 30% des Gewichtes in Glycerin)

• Dimethylsufoniopropionat -> wird zu Dimethylsufid in Atmosphäre -> Klimawandel (Wolekenbildung)

• Dimethylsufoniopropionat -> Dimethylsufid + Acrylat (Woklenbildung)

• compatibele Solutes werden um Enzyme angealgert -> simulieren Hydrathülle -> halten Enzyme intakt

• Denaturierte Proteine/Enzyme (Inclution-bodies) nach Zugabe von osmoprotoktive Substanzen: z.B bei Insulinproduktion (in vitro aktivierung nach Produktion in E.coli und Gewinnung)

1. chemische Chaperone für die Proteinfaltung

2. Optimierung von PCR-Reaktionen (DNA-Stabilisierung)

3. Gefrierschutz für Mikroorganismen und Organe

4. Einsatz in Kosmetika

5. Formulierung von Wirkstoffen

6. Generierung von Stress-ressistenten transgenen Organismen
 

• Üerproduktion durch Stamm mittels Vestärkung der Promotoren, Stoffwechselproduktivität des Stammes erhöhen.

• 1. Schritt: Fed-Batch-Fermentation von H.elongata zu hohen (maximalen)Zelldichten bei hohem osmotischen Druck (Substratlimitiertes Wachstum, bei zuviel Substrat würde es zu einem Energieüberschuss kommen -> schädlich für Zellen -> bei Substratlimit -> Crabtree-Effekt)

• 2. Schritt: Aufkonzeantration der Zellen (Durchflussfiltration)

• 3:Schritt: Hypoosmotischer Schock (niedrige Salzkonz.) -> dadurch Freisetzung der überschüssigen osmoprotectiveb Ectoin-Konzentration ins Medium (Melkprozess)

• 4.Schritt: Aufkonzentrierung der Zellen

• 5.Schritt: Hyperosmotischer Schock, Anregung erneuter Ectoinsynthese

• (~ 30 Zyklen möglich)

• Sonnenschutz, Anti.Aging, Dermo-Kosmetik nutzen Ectoin-Produktion

• 1000fache resistenter gegenüber UV- und ionisierender Strahlung

• ungewöhnlich dicke Zellwand → Abfang von UV-Strahlung

• Nukleoid, sehr kompakt in Ringstruktur (torusartige Struktur) → DNA-Schäden meist Einzelstrangbruch oder Doppelstrangbruch → DNA Bruchstücke bleiben zusammen

• Reparaturmechanismen in Deinococcus radiodurans:

• schnelle Reparatur

• kann DNA effizient Reaprieren

• Beheben von DB möglich

• hat mehrere (2-4) gleiche Chromosomen → mehrere Kopien jedes Gens → nach hoher Strahlenbalastung Rekombination möglich (durch Reparaturenzyme, Exonuklease-Funktion → Einzelstrang-DNA-Bereiche werden synthetisiert → homologes alignment an intakte DNA-Kopie)

Schädigung durch Bildung von Pyrimidindimeren

• Cyclobuthyl-thymindimer

• durch UV-Strahlen (zu langes Sonnenbaden)

• → Unterbrechungen in der korrekten Basensequenz

• → Punktmutationen bei der Replikation

• → bei zu vielen Schädigungen, Reparatursysteme überfordert

• → meist treten mutierte Zellen ab, wenn nicht Hautkrebs

• Photolyase für DNA-Reparatur

• → erkennt Cyclobuthyl-thymindimer

In Sonnencremes enthalten....nur Werbezweck...müsste bis zum Kern vordringen! <- Wirkung eher unwahrscheinlich!

• magnetotaktisches Bakterium
• aus dem Ryck
• Magnetotaktische Bakterien enthalten Magnetosomen
• -> entsprechend des magnetischen Erdfeldes ausrichten.
• In den Magnetosomen befinden sich Magentitpartikel aus Fe3O4

.

- Diagnostische Tools. Immobilisierung von z.B Enzymen, DNA-Sonden und Antikörpern

- Zellseperation

- Therapeutische Tools:

• Einschluss von Magnetpartikeln in immunogenen Zellen.
• Führung dieser Zellen über ein Magnetfeld z.B an einen Tumorherd

Technischer Einsatz als Kontrastmittel für das Magnetische Resonanz Imaging

Metagenomics

Gewinnung Klonierung von Genen aus Umweltproben ohne Kultivierung der Wirtszellen

Sequenzierungstechnik

• früher Sanger-Technik

• heute Shotgun-Technik

• Einzelzellen-Isolation → Genomsequenzion

• Metagenom-Bestimmng

- DNA-Template über DNA-Adapter an Beads gebunden und auf Mikrotiterplatte überführt. (mit Lichtleitern an Detektor gekoppelt)

- Zusätzlich zu Polymerase und Primer -> Enzymmix (Sulforylase, Luziferase, Apyrase)

- ein Mix mit nur einem der 4 dNTPs hinzugefügt

- Einbau von einem dNTP -> PPi-Abspaltung -> von Sulforylase in ATP -> Lichtblitzerzeugung durch Luziferase mittels ATP -> von Detektor gemessen.

- restliche dNTPs werden mit Apyrase abgewaschen

-> nächster dNTP-Mix

Kalkulation der Mindestanzahl an Klonen:

• um mit einer vorgegebenen Wahrscheinlichkeit alle Gene des Genoms in der Bibliothek zu erfassen.
• N=ln(1-P)/ln(1-F)
• N = Anzahl der erforderlichen Klone
• P = Wahrscheinlichkeit für vollständige Bibliothek (z.B P=0,95 für 95%)
• F = Ge/Go (Quotient aus vermuteten durchschnittl. Gengröße (Ge) und Genomgröße (Go)

mit Hilfe von Plasmiden: