Molekularbiologie- Biotechnologie/Gentechnik

rekombinante DNA, mit der wiederum gentechnisch veränderte Organismen (GVO) hergestellt werden können.

• Verfahren zur Vervielfältigung von kurzen DNA-Segmenten
• Ziel: aus den gesamten DNA ein spezifischer Abschnitt rauskopieren und vervielfältigen

1) Denaturierung

• doppelsträngige DNA auf 94-96 Grad erhitzen: Wstb aufbrechen. Ausgangs-DNA und Primer trennen, Einzelstränge liegen vor.

2) Anhybritisierung

• anhybritisieren der Oligonucleotidprimer bei 50-60Grad. --> spez. Anlagerung des Primers an DNA

3) Synthese

• DNA- Polymerase füllt fehlende Stränge mit freien Nucleotiden auf
• Beginnt am 3'-Ende des angelagerten Primers und folgt dann DNA-Strang
• Primer wird nicht abgelöst. Bildet Anfang des neuen Einzelstrangs.

• Mit Gelelektrophorese können DNA-Fragmente nach ihrer Grösse aufgetrennt werden
• Sortierung nach Ladung und Grösse
• = molekulares Sieb

1. trennt Makromoleküle aufgrund der Wanderungsgeschwindigkeit durch Polygel bei el. Spannung. Nucleinsäuren durch Phoshatgruppen negativ geladen --> wandern im el. Feld zur Anode.
2. Gemisch aus DNA-Molekülen in Abfolge von Banden aufgetrennt
3. Jedes Band enthält Moleküle derselben Länge.
4. Mit Ethidiumbromid werden DNA-Fragmente sichtbar gemacht--> UVA-Licht 

• Vaterschaftstest
• genetischer Fingerabdruck
• erkennen von Krankheiten
• Analyse alter DNA
• Geschlechtsbestimmung

bestimmte nicht codierende Abschnitte auf der DNA untersuchen (Short Tandem Repeats), die aus einer variablen Anzahl an Wiederholungen einer Sequenz von Basenpaaren bestehen.

Anzahl an Sequenzwiederholungen wird vererbt und variiert von Mensch zu Mensch.

Bei der DNA-Sequenzierung nach Sanger werden nun die vier natürlichen dNTPs und eines der vier artifiziellen ddNTPs zu einem PCR-Ansatz mit der zu sequenzierenden DNA und einem entsprechenden Primer gegeben. Die Polymerase baut nun gelegentlich in statistischer Verteilung ein ddNTP ein, wodurch die Polymerisation abbricht. Es entsteht somit ein Gemisch unterschiedlich langer Stücke des zu sequenzierenden Abschnitts der DNA. Man führt dieses Experiment mit allen vier ddNTPs durch und trägt die vier Ansätze in einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese nebeneinander auf. Aus dem Muster der entstehenden Banden kann man dann die Abfolge der Basen auf dem DNA-Abschnitt ablesenbasiert auf PCR

1. ganzer Satz von DNA-Strängen synthetisieren: komplementär zur ursprünglichen DNA-Fragmente
2. Strang nimmt von gleichen Primer Ausgang und endet mit ddNTP.--> führt zu Kettenabbrung, weil OH-Gruppe am 3'-Kohlenstoff der Desoxyribose fehlt.DNA-Polymerase keine Base anfügen.
3. 4 Reaktionsgefässe unterschieden sich im Vorhandensein von unterschiedlichen ddNTP's: jedes der vier ddNTP's mit anderen Fluoreszentfarbstoff markiert. Fluoreszenzsignal enthüllt Identität des Nucleotids an sienem 3'-Ende.

Verfahren, um Reihenfolge der Nucleotidbasen in DNA zu bestimmen.

Herstellung von identischen Genkopien zwecks Forschung und Anwendung

1. Gen wird in das Plasmid insertiert
2. Plasmid wird in die Bakterienzelle eingeschleust
3. Die Wirtszelle vermehrt sich im Kulturmedium und bildet einen Klon, der das klonierte Zielgen enthält.
4. Grundlageforschung und Anwendung

1. Restriktion des Vektors
2. Isolation eines DNA-Fragments
3. Rekombination des Vektors
4. Transformation in die Wirtszelle
5. Vermehrung der Wirtszelle
6. Selektions des gesuchten Klons
7. Kultivierung des gesuchten Klons

Enzyme, die DNA an einer spezifischen Erkennungssequenz schneiden ( Resktriktionsschnittstelle)

1. ein Restriktionsenzym zerschneidet das Zuckerphosphatgerüst an den durch Pfeile bezeichneten Stellen
2. Zugabe eines DNA-Fragments aus einer anderen Quelle, welches mit gleichen Restriktionsenzym geschnitten wurde-->  Basenpaarungen der Einzelstrangüberhänge.
3. DNA-Ligase verknüpft die Stränge kovalent = rekombinantes DNA- Molekül

• Insulinproduktion
• Gentherapie
• Herstellung von transgenen Tieren
• Klonen (Embryoteilung & Kerntransfer)

• Embryoteilung
• Kerntransfer (Dolly)

• Herbizide sind Wirkstoffe zur Unkrautbekämpfung

Enzym EPSP- Synthase setzt Shikimat und Phosphoenolpyruvat zu EnolPyruvylShikimat-3-Phosphat um -->  Vorläufer der Synthese der Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin.

• Glyphosat konkurriert mit Phosphoenolpyruvat um den Platz im aktiven Zentrum des EPSP
• hemmt  Synthese von EnolPyruvylShikimat-3-Phosphat
• verhindert, dass Pflanze Aminosäuren synthesisieren kann--> Tod

- klonen mit viralen Promotor und EPSP-Synthase in Agrobacterium : Effekt unbefriedigend

- GAT Enzym hängt Acetyl-Gruppe an Glyphosat: klonen --> unschädlich : zu wenig effizient

+ muligene shuffeling: künstliche Herstellung des GAT-Gens

1. zerstücklen und neu zusammensetzten der drei Varianten des GAT-Gens
2. durch mixen der 3 Gene --> neue Varianten
3. 11 Zyklen des mulitgene shuffeling : besten Varianten werden wieder gemixt
4. Wirkungsweise nach 11 Zyklen: 1000 Mal besser

• Höhrere Eträge pro Fläche durch verbesserte Pflanzenschutz
• geringere Kosten für Pestizideinsatz
• resistenter gegen Schädlinge
• einfach anwendbar
• billig
• für alle verfügbar

• indirekte Kosten
• Abnahme der Biodiversität
• entwicklung von resistenten Unkräutern
• fehlende Kontrollierbarkeit
• langzeiswirkungen unbekannt
• übernutzung der Böden