M4 K. 2013
Fichier Détails
| Cartes-fiches | 24 |
|---|---|
| Langue | Deutsch |
| Catégorie | Biologie |
| Niveau | Apprentissage |
| Crée / Actualisé | 28.04.2015 / 02.01.2019 |
| Lien de web |
https://card2brain.ch/box/mikrobiologie_4_arbeiten_mit_expressionsvektoren
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| Intégrer |
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A1 a) Erläutern Sie die genetischen Elemente von procaryotischen und eucaryotischen Expressionsplasmiden für die Expression eines EGFP-Fusionsproteins.
Promotor: Es muss ein Promotor vor das Gen gebaut werden, an dem die Transkription starten kann (z.B. CMV als sehr starker, konstituiver Promotor).
MCS: Zum Einfügen des gewünschten Proteins, das mit dem GFP markiert werden soll.
Ori: =Origin of replication, von dem dieVermehrung des Plasmids aus starten kann (um identische Kopie bei Proliferation an Tochterzelle weiterzugeben).
Resistenzen: Zur Selektion transformierter Zellen (nicht transformierte sterben)
-> ampr bei Bakterien (procaryotische Plasmide)
-> ampr + neo (Neomycin) bei Zellkultur (eucaryotische Plasmide)
GFP-Gen: Zur Synthese des GFPs
Zusätzliches:
=> bei Eucaryoten: Poly-A-side zur Polyadenylierung der eucaryotischen mRNA
=> bei Procaryoten: Shine-Delgarmo-Sequenz. = Ribosombindestelle! (Bindungssignal auf procaryotischer mRNA für die Ribosomen)
+ Terminator (Stoppsignal auf procaryotischer mRNA für die Ribosomen)
A1 b) Ordnen Sie die in a) genannten Elemente des eucaryotischen Expressionsplasmids für mit Hilfe einer Zeichnung auf einem ringförmigen DNA-Molekül in seiner sinnvollen Weise an.
Promotor-> MCS-> EGFP-Gen-> Poly-A-site-> neo-> Ori-> ampr
A1 c) Erläutern Sie, worauf man bei der Klonierung einer DNA-Sequnez für das EGFP-Fusionsprotein unbedingt beachten muss, damit es zu einer korrekten Synthere des Fusionsproteins kommt.
->dass das EGFP im gleichen Leseraster liegt wie das Protein, an das es gebunden werden soll. (Ist das nicht der Fall, kann das EGFP nicht sythetisiert werden, da es im falschen Leseraster liegt und bei der Translation eine völlig ander AS-Sequenz gebildet werden würde)
->dass kein Stoppcodon zwischen den Genabschnitten liegt, denn sonst würde es ja nicht als Fusionsprodukt exprimiert werden.
A2 a) Erläutern Sie, was beim lysogenen Zyklus mit dem Lamdaphagen geschieht und auf welche Weise der lysogene Zyklus aufrechterhalten wird.
-Phage bringt seine DNA in die Wirstzelle ein
-Integrase integriert Phagen-DNA ins Wirtsgenom (spez. an der attachment-side)
-LamdaC!-Repressor unterdrückt die Transkription der Phagen DNA
=> lysogener Zyklus wird aufrecht erhalten solange der Repressor intatkt ist (Phagen-DNA bleibt integriert und wird bei einer Proliferation mit an die Tochterzelle weitergegeben)
Der lysogene Zyklus wird abgebrochen sobald der Repressor inaktiviert ist. Dann setzt der lytische Zyklus ein.
A2 b) Erläutern Sie, wie es zur Induktion des lytischen Zyklus kommt.
- wenn sich z.B. Umweltbedingungen der Wirtszelle verschlechtern (Bsp.: UV-Bestrahlung).
- Repressor wird von wirtseigenen Enzymen abgebaut und ist somit inaktiv
- Lamda-Gene können exprimiert werden, Phagen-DNA wird wieder herausgeschnitten -> lytischer Zyklus setzt ein!
A2 c) Beschreiben Sie den weiteren Lenbenszyklus des Lamdaphagen nach der Induktion des lytischen Zykluses.
-Phagen-DNA wird aus Wirtsgenom ausgeschnitten
-Phagen-DNA wird vervielfältigt (Latenzphase)
-Phagen-DNA wird transkribiert, Bauteile für neue Phagen werden produziert
-Gleichzeitig wird das Wirtschromosom zerstört
-Neue Phagen werden zusammengebaut (je ein Molekül der Phagen-DNA wird im Kopf des neuen Phagen "eingepackt")
-Schließlich platzt die Zelle und setzt die neuen Phagen in die Umgebung frei (lytische Phase)
-Jeder neue Phage kann jetzt eine neue Wirtszelle befallen.
A2 d) Nennen Sie zwei Arten von Klonierungsvektoren, die aus dem Genom des Lamdaphagen abgeleitet sind und Fremd-DNA übertragen können.
Insertionsvektoren & Replacementvektoren
A3 a) Zeichnen Sie den Aufbau eines Cosmides,
Siehe Bild
A3 b) Erklären Sie warum Cosmide im Vgl. zu Plasmiden für die Klonierung von deutlich größeren Inserts geeignet sind.
Cosmide sind Teile des Lamda-Genoms aus dem alle Bereiche entfernt wurden, die nicht unbedingt notwendig sind oder für den Versuch schädlich sein könnten ("lytische Gene"). Durch all diese entfernten Gene wurde viel Platz für neue, zu transferierende, Gene geschaffen. Das Insert kann bis zu 45kb groß sein (zum Vgl. auf ein Plasmid passen nur 2kb, in den Lamdaphagen normalerweise 25kb).
Klonierungsplasmide werden über Transfektion übertragen, Cosmide über Transduktion.
A4
Für ein Transfektionsexperiment sollen LB-Agarplatten hergestellt werden. Die Agarplatten sollen eine Endkonz. an Amp. von 100mikroG/mL sowie eine Endkonz. an Arabionose von 25mg/mL enthalten. Es stehen die jeweiligen Stocklösungen von Amp. c=450mg/mL und Arabionose c=500mg/mL zur Verfügung.
Berechnen Sie die Mengen an Amp.- bzw. Arabinose-Stocklsg., die für 1,5L LB-Agar benötigen. Geben Sie die jeweiligen Rechenwege an.
Amp:. 450mg/mL : 0,1mg/mL = 4500 (Vf)
1500mL : 4500 = 0,33mL = 333mikroL
Arabinose:. 500mg/mL : 25mg/mL = 20 (Vf)
1500mL : 20 = 75mL
A5
Das Arabinose-Operon spielt ebim Abbau von Ara. in Bakterien eine wichtige Rolle. Durch Zugabe von Arabinose zum Kulturmedium lässt sich die Transkription der entsprechenden Gene induzieren.
Erläutern Sie diesen Mechanismus mit Hilfe einer Zeichnung.
Arabinose setzt sich auf den araC-Repressor, der zuvor verhinderte, dass das Gen abgelesen wird. Der Repressor ist jetzt inaktiviert und die Polymerase kann sich anlagern und mit der Transkription starten.
A6 a)
Mit Hilfe von Plasmid-Expressionsvektoren lassen sich klonierte Gene exprimieren. Dazu werden verschiedene Arten von Promotoren verwendet.
Nennen Sie drei verschiedene Arten von Promotoren zur Genexpression.
Induzierbare Promotoren, Gewebsspezifische Promotoren & konstituive Promotoren
A6 b)
Mit Hilfe von Plasmid-Expressionsvektoren lassen sich klonierte Gene exprimieren. Dazu werden verschiedene Arten von Promotoren verwendet.
Erläutern Sie kurz an Hand von Beispielen, für welche Art von Experimenten der Einsatz der speziell regulierten Promotoren vom großen Nutzen ist (nur für zwei der Arten von Promotoren)
Konstituive Promotoren: z.B. wenn an ein bestimmtes Protein ein Tag angefügt werden soll um dessen Lokalisation in der Zelle zu überprüfen (Bsp.: GFP). Das "Fusionsgen" wird absichtlich überexprimiert, sodass das Ergebniss deutlich erkannt werden kann.
Gewebsspezifische Promotoren: z.B. wenn ein bestimmtes Gen nur in einem bestimmten Gewebe exprimiert werden soll, kann ein gewebsspez. Promotor davorgesetzt werden
-> Gen, dass in allen Zellen vorhanden ist, aber nur in bestimmten Geweben exprimiert wird, sodass nur dort dieses eine bestimmte Protein zufinden ist.
A7 a)
Für die Transfektion (nicht-viraler-Gentransfer) in eucaryotische Zellen sind verschiedene Methoden im Labor gebräuchlich.
Nennen Sie 4 verschiedene Methoden.
-Camcium-Phosphat-Copräzipitation
- Lipofektion
-Genegun
-DNA-Mikroinjektion
A7 b)
Für die Transfektion (nicht-viraler-Gentransfer) in eucaryotische Zellen sind verschiedene Methoden im Labor gebräuchlich.
Erklären Sie kurz für jede Methode, wie die Aufnahm der Fremd-DNA in die Zelle erfolgt.
-Calcium-Phosphat-Copräzipitation
Die DNA bildet mit Calcium- und Phosphationen ein Präzipitat, welches auf die Zellen gegeben und über Endozytosche aufgenommen wird und so in den Zellkern gelangen kann.
- Lipofektion
Die DNA wird an positiv geladene Lipide gebunden. Die Lipide fusionieren mit der Plasmamembran der Zelle und setzen die DNA in die Zelle frei
-Genegun
DNA wird an Gold-Nanopartikel gebunden. Diese werden dann auf die Zellen geschossen.
-DNA-Mikroinjektion
DNA wird in gelöster Form über eine Kapillare direkt in einzene Zellen eingesprizt.
A8 Für ein Transfektionsexperiment sollen 107 HEK-Zellen in 20mL DMEM-Medium in 10cm Kulturschalen eingesät werden. Sie benötigen insgesamt 12 Schalen. Eine Zellzahlbestimmung der Ausgangskultur ergibt eine Zellzahl von 2x108 Zellen/mL.
Berechnen Sie die Menge an Ausgangszellsuspension, die Sie für die Vorbereitung der 12 Schalen insgesamt benötigen.
107 Zellen : 2x108 Zellen/mL.=0,05mL
0,05mLx12 (Schalen)=0,6mL =600mikroL der Ausgangszellsuspension
A9 Embryonale Stammzellen werden aus Blastocysten isoliert und können zur Herstellung von transgenen Toeren verwendet werden.
Diskutieren Sie die Vorteile von ES Zellen für das Einbringen und Exprimieren eines Fremdgens im Vgl. zur Mikroinjektionstechnik für die Herstellung transgener Mäuse
Vorteile von ES Zellen:
- Gene können gezielt verändert, hinzugefügt oder deletiert werden (bei Mikroinj. können nur bestimmte Gene hinzugegeben werden)
- Selektionierung der ES Zellen bevor sie in die Blastozyste zurückgegeben werden. => gesteigerte Effizienz im Vgl. zur Mikroinj. (bei der Mikroinj. müssen Tiere erst geboren werden, um Ergebniss einsehbar zu machen).
Gleich:
- "Tierverbrauch" -> bei beiden Methoden müssen einem Tier Eizellen entnommen, behandelt und einem anderen scheinschwangerem Tier eingesetzt werden.
Nachteile von ES Zellen:
- Transfektion von ES Zellen benötigt mehr Zeit, da Zellen kultiviert,transfiziert,selektioniert und vermehrt werden müssen (Mikroinj. viel schneller!)
=> Trotz des erhöhten Zeitaufwand hat die Transfektion viele wichtige Vorteile gegenüber der Mikroinj..
A10 a) Welche der Aussagen treffen zu?
A10 b) Welche der Aussagen treffen zu?
A11 a) Welche der Aussagen treffen zu?
A11 b) Welche der Aussagen treffen zu?
A12 Im Rahmen einer Gentherapie soll ein neues Gen in Blutstammzellen eingebracht werden, um ein durch Mutation zerstörtes Gen zu ersetzen.
Welche Eigenschaften machen retrovirale Vektoren im Gegensatz zu adenoviralen Vektoren zur geeigneten Genfähre?
A13 a) Für neue Gentherapiestudien wurden Vektoren auf der Basis von Lentiviren entwickelt.
Welche Vorteile bieten diese lentiviralen Vektoren gegenüber den bisher verwendeten retroviralen Vektoren?
A13 b) Für neue Gentherapiestudien wurden Vektoren auf der Basis von Lentiviren entwickelt.
Welche Vorteile bieten diese lentiviralen Vektoren gegenüber den bisher verwendeten retroviralen Vektoren?
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