Isolation & Nachweis von Nukleinsäuren und Proteinen

Lambert-Beersche-Gesetzt

Nukleinsäuren absorbieren monochromatisches Licht, je nachdem wieviel sie absorbieren ist die Konzentration

Spektrophotometrie

bei 260nm absorbieren Nukleinsäuren 1.8x soviel wie bei 280nm (Maximum von Proteinen)

A260/A280 = Reinheit

bei DAN sollte es 1.8, bei RNA 2.0 sein

man multipliziert die A260

• bei DNA mit 50
• bei RNA mit 40

und erhält die Konzentration in ug/ml

anfärbung von proteinen im polyacrylamidgel, anheftung an basische seitenketten

gel muss erst fixiert werden (z.B: mit  TrichloressigsäurE), da Coomassie saures Milieu für Bindung benötigt

semi-quantitative Bestimmung von Proteinen

nicht so sensitiv wie silberfärbung, kann bei vielen basischen, armoatische AS nicht verwendet werden.

visualisieren von Proteinen im Polyacrylamid-gel, Silber-Ionen binden an negativ-geladenen Seitenketten

10-100 fach sensitiver als Coomassie (0.1-1ng pro Bande)

• Fixierung des Gels mit Essigsäure/Ethanol
• Mit Silbernitrat behandelt AgNO3
• Ag+ binden an Proteine
• mit alkalischen Formaldehyd zu elementarem Ag reduziert --> schwarz
•  

nur eingeschränkt zur Quantifizierung verwendet, da manche Proteine sehr stark und andere gar nicht gefärbt werden

roter Azofarbstoff, auf der Membran, Kontrolle ob blot funktioniert hat

bindet an positive Aminogruppe der Proteine

kann mit destilliertem Wasser abgewaschen werden

ein Blot ist die Übetragung bestimmter Substanzen auf eine Membran zur anschließenden Detektion, Identifikation und Quantifizierung

• Southern-Blot: DNA
• Northern Blot: RNA
• Western-Blot: Proteine

• Kapillarblot
• Semi-Dry Blot
• Wet/Tank Blot

Übertragung von einem Agarose-Gel auf eine Membran (meist DNA/RNA --> Northern/Southern Blot)

Gel und Membran zwischen Filter-Papier in einem Tank.

Der Puffer wird durch die Sogwirkung durch das Gel und die Membran in das Filter-Papier gezogen, dabie werden die Fragmente auf die Membran übertragen

Anschließend durch UV-Cross-linking auf der Membran fixiert

gel & membran kommen horizontal zwischen filter-papier Stape, die in Puffer getränkt sind

zwischen 2 Graphit-Platten --> Spannung direkt angelegt,

Kann für Poly-Acryl-Amid-Gel und SDS Page angewendet werden (=Northern, SOuthern und Western-Blot)

• Gel zwischen 2 Lagen Filter-Papier,
• vertikal in einen Behälter mit Puffer,
• von 2 porösen Pads gehalten,
• zwischen 2 Elektroden

Nylon

• hohe Lebensdauer
• reparierbar
• bindet irreversibel
• verschiedene Typen (geladen, ungeladen, etc.)

Nitrocellulose

• RNa bindet sehr fest
• aber sonst niedrige Bindungsfähigkeit
• brüchig & verformbar bei falscher Temp.

beide könen einzel & doppelstränge binden

mit Sonden --> kurze für das Fragment spezifische, komplementäre Stücke

werden markiert

• radioaktiv
• fluoreszierend
• antikörper/antigen (z.B: Dioxigenin, AK mit Enzm gekoppelt --> Farbreaktion)

dienen nur dem positiven Beweis, keine Bindung bedeutet nicht, das Sequenz nicht vorhanden ist

Mittels Antikörpern, die an die Proteine binden

Primär-AK

• bindet an Proteine auf der Membran
• unspezifische Bindungen weggewaschen

Sekundär-AK

• trägt Marker
• bindet an primär-AK (mehrere)
• amplifikation des signals --> Proteine sichtbar

Detektion entsprechend der Markierungsmethode

Die MEmbran bindet an Proteine, AK sind auch Proteine

AK würden an der gesamten Membran gebunden werden udn nicht nur an den Stellen mit Proteinen

Blockierung der freien Bindungsstellen mit Proteinen die für den AK nicht erkennbar sind z.B: Rinderserualbumin, Gelatine, oder chemische Polymere

• Membranzerstörer (z.B: CTAB oder SDS)
• Protein-Denaturierer (= Reduktionsmittel, z.B. beta-Mercaptoethanol)
• Chelatbildner um freie Ionen zu fangen (z.B: EDTA)
• Puffer (meist TRIS, ph 8)
• Salz (NaCl, neutralisiert LAdungen der DNA)

Phenol-Extraktion

• DNA in wässriger Phase
• denaturierte Proteine in Interphase
• Proteine in organischer Phase

Phenol-Chloroform-Extraktion

PRoteine besser denaturiert, pH Wert bestimmt, was sich wo anlagert

niedrig: (Ladungen durch PRotonierung neutralisiert, außer RNA, bildet WBB)

• RNA wässrige Phase
• Große DNA Fragmente & Proteine Interphase
• Proteine & kleine DNA Fragmente organische Phase

neutral bis alkalisch

• DNA & RNA in wässriger Phase

Phenol-Chloroform

• DNA in wässriger Phase
• Ethanolfällung
• pelletiert
• in Puffer gelöst
• RNAse Behandlung

Phenol-Chloroform-Guanidin-Extraktion

• Guanidin-Isothiocyanat inaktiviert RNAsen
• RNA in wässriger Phase
• Ethanol/Isopropanol gefällt
• DNAse Behandlung (für PCR)

Einstellung des pH und des Salzgehalts ermöglichen Spezifische Bindugn von DNA oder RNA am Kieselgel

durch Zugabe von Salz werden Ladungen abgeschirmt --> weniger hydrophile

ABER noch nicht ausreichend

Ethanol/Isopropanol hinzugegeben --> erleichtert Neutralisation

Kühlungsprozess fördert den Fällungsprozess

Vorteile

• DNA fällt bei niedriger Konzentration aus
• man braucht geringe Mengen

Nachteile

• auch Salz fällt aus
• um Salz zu entfernen muss oft mit Ethanol gewaschen werden

Vorteil

• Salz fällt nicht aus

Nachteil

• höhere DNA Konzentration nötig

Gel-Elektrophorese

• SDS-Page
• Isoelektrische Fokussierung

• Ethidiumbromid
• SYBR (Green II)

• Silberfärbung
• Coomassie

Oligo-Sonden

• Ponceau S
• Antikörper