Cartes mémoires M3 Molekulare Klonierung

Cartes-fiches	37
Langue	Deutsch
Catégorie	Biologie
Niveau	Apprentissage
Crée / Actualisé	09.02.2015 / 15.02.2015
Lien de web	https://card2brain.ch/box/m3_molekulare_klonierung
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Wie kann man fremde DNA in Bakterien einbringen? Erläutern Sie zwei verschiedene Mechanismen.

- Hitzeschock (/CaCl₂-Behandlung) 10⁶-10⁸ cfu/mikro'g DNA
Kompetente Zellen (aus log. Wachstumsphase) + DNA
-> Inkubation auf Eis
-> Hitzeschock 42°C*
-> Zugabe von LB-Medium
-> 1h Inkubation bei 37°C, dann ausplattieren

- Elektroporation (Salzfrei) 10⁸-10¹⁰ cfu/mikro'g DNA
Kompetente Zellenin H₂O resuspensieren
-> Bakterien + DNA
-> Elektroschock in einer Elektroporationsküvetten*
-> Zugabe von LB-Medium
-> 1h Inkubation bei 37°C, dann ausplattieren

* Zellmembran wird permeabel und kann DNA aufnehmen

Erläutern Sie den Restriktionsmechanismus.

1) Bildung eines Enzym-Nukleotid-Intermediats
AS wird auf Aminogruppe der Lysin-Seitenkette übertragen

2) Übertragung des AMP auf's 5'-P-Ende des offenen DNA-Stranges

3) Bildung der Phsophordiesterbindung durch 3'-OH-Gruppe mit aktivierter 5'-P-Gruppe
-> AMP wird freigesetzt

Wie sieht der Ablauf einer molekularen Klonierung aus?

1) Präparation: mit RE=> Insert + Vektor

2) Ligation: mit Hilfe einer Ligase => recombiniertes Plasmid

3) Transformation: Schocktherapie => Einbringen des Plasmids in kompetente Bakterien
--> anschließende Vervielfältigung durch Plasmidreplikation und Zellvermehrung

4) Kontrolle/ Selektion: ausplattieren=> recombinierte Klone

Welche zwei Möglichkeiten der Präparation gibt es?

1) gerichtete Kolnierung mit 2 verschiedenen RE
=> Ligation des Inserts ist nur in einer Orientierung möglich. Religation des vektros ist nicht möglich

2) ungerichtete Kolnierung mit nur einem RE

Wie kann ich eine RE-Erkennungssequenz synthetisch an mein Insert bzw. meinen Vektor anbringen?

In dem ich während einer PCR einen modifizierten Primer herstelle

Erläutern Sie das Methodenprinzip der Plasmid-DNA-Isolation mittels Anionenaustauscherchromatographie.
(Beginnend mit einer Übernachtkultur)

1) Übernachtkultur (im Eppi) runterzentrifugieren

2) Überstand verwerfen und Pellet in einem neut. Puffer (Sol.1) resuspensieren

3) Zellyse durch Sol. 2 (NaOH + SDS)
-> SDS ist 'n isotonisches Detergenz, zerstört Zellmembran
-> NaOH erzeugt alk. pH-Wert, chromosomale DNA denaturiert

4) Neutralisation durch Kaliumacetat/ Essigsäure (Sol.3)
-> KaliumAc bildet mit dem SDS unlösliche Komplexe, an denen chromosomale DNA & Proteine hängen bleiben; chaotrophe Salze entziehen den Plasmiden die Hydrathülle

5) unlösliche Komplexe runterzentrifugieren -> Plasmide im Überstand

6) Überstand in Silikasäule aufreinigen:
   --> Bildung von Kationbrücke zwischen Silicamembran & DNA
   -> WASCHEN und Durchfluss verwerfen
   -> DNA mit Elutionspuffer o. ddH₂O eluieren (niedriger Salzgehalt, Na⁺-Brücke wird aufgelöst)

7) abzentrifugeren => Plasmid-DNA im Durchfluss

|) Das Methodenprinzip der Plasmid-DNA-Isolation mittels Anionenaustauscherchromatographie.
besteht aus mehrern Schritten. Erläutern Sie was im dritten Schritt geschieht?

3) Zellyse durch Sol. 2 (NaOH + SDS)
-> SDS ist 'n isotonisches Detergenz, zerstört Zellmembran
-> NaOH erzeugt alk. pH-Wert, chromosomale DNA denaturiert

||) Das Methodenprinzip der Plasmid-DNA-Isolation mittels Anionenaustauscherchromatographie.
besteht aus mehrern Schritten. Erläutern Sie was im vierten Schritt geschieht?

4) Neutralisation durch Kaliumacetat/ Essigsäure (Sol.3)
-> KaliumAc bildet mit dem SDS unlösliche Komplexe, an denen chromosomale DNA & Proteine hängen bleiben; chaotrophe Salze entziehen den Plasmiden die Hydrathülle

|||) Das Methodenprinzip der Plasmid-DNA-Isolation mittels Anionenaustauscherchromatographie.
besteht aus mehrern Schritten. Erläutern Sie was im sechsten Schritt geschieht?

6) Überstand in Silikasäule aufreinigen:
   --> Bildung von Kationbrücke zwischen Silicamembran & DNA
   -> WASCHEN und Durchfluss verwerfen
   -> DNA mit Elutionspuffer o. ddH₂O eluieren (niedriger Salzgehalt, Na⁺-Brücke wird aufgelöst)

Difinieren Sie den Begriff Transformationseffizienz.

= bei wie viele Bakterien bzw. cfu's die Einschleusung von DNA erfolgreich war.
-> Wird in cfu/ mikro'g DNA angegeben

Nach einer Transformation und Inkubation von Bakterien über Nacht bei 37°C erhalten Sie 55 Koloien auf 1/4 Ihrer LB-Amp-Agarplatte.

Transformationsansatz: Supercoiled Plasmid-DNA (c= 850mikro'g/mL), 1:100 verdünnt, davon 5 mikoL eingesetzt. Kompetente Zellen: 100 mikroL E.coli

Berechnen Sie die Transformationseffizienz Ihrer komponenten Zellen und beurteilen Sie diese.

55cfu x 4 = 220 cfu

850mikro#g/mL ; 1:100 -> 8,5mikro#g/mL = 8,5x10^-3mikro#g/mikroL

8,5x10³mikro#g/mikroL x 5mikroL = 0,0425mikro#g DNA

Transformationseffizienz: 220cfu/ 0,0425mikro#g = 5176cfu/ mikro#g DNA

-> eine Te. von ca. 5x10³ ist sehr gering. Bei der Hitzeschockmethode sollte Sie bei 10⁶- 10⁸, bei der Elektroporation sogar bei 10⁸- 10¹⁰ liegen.

Nennen Sie zwei Subsatnzen, die beim Blue/White-Screening zusätzlich eingesetzt werden und ihre Funktion.

X-Gal ist ein Substrat, das von der ß-Galaktosidase gespalten (hydrolysiert) wird, dabei entsteht ein blauer Farbstoff.

IPTG ist ein Indujtor für das Lac-Z-Gen. Es bindet an den Repressor und inaktiviert ihn so. Die Transkription des Gens kann dann starten.

Beschreiben Sie kurz die biologische Bedeutung von R-, F- und Degradations-Plasmiden.

Commandes clavier:

= tourner,

= avant/arrière,

= faire défiler

- Resistenzplasmide: Vermitteln den Bakterien Resistenz gegen ein bestimmtes Antibiotikum/ eine bestimmte Klasse von Antibiotikum.

- Degradationsplasmide: Ermöglichen den Abbau ungewöhnlicher Substanzen.

- Fertilitätsplasmide: Ermöglichen die Ausbildung eines Sex-Pilus zum horizontalen Gentransfer.

Ihre Plasmid-DNA soll mit Kpn1 geschnitten werden. Sie liegt in der Konzentration 2,5mikro'g/mikroL vor. Kpn1 hat eine Aktivität von 5u/mikroL. Sie möchten 15mikro'g Plasmid-DNA in 120 min. bei 37°C schneiden.

Stellen Sie einen Restriktionsansatz zusammen, der ein Endvol. von 30mikroL hat.

Commandes clavier:

= tourner,

= avant/arrière,

= faire défiler

DNA: 2,5mikro'g/mikroL
=> 15mikro'g : 2,5mikro'g/mikroL = 6mikroL

Kpn1: 5u/mikroL ; 1u schneidet 1mikro'g DNA pro h
> 15u Kpn1 schneideen also 15mikro'g DNA in 1h
-> 7,5u Kpn1 schneiden 15mikro'g DNA in 2h

=> 7,5u/ 5u/mikroL = 1,5mikroL

Puffer: 10xPuffer -> 30mikroL :10= 3mikroL

Wasser: 30mikroL - 6mikroL - 1,5mikroL - 3mikroL = 19,5mikroL

Zeichnen Sie einen Plasmidvektor, der alle nötigen Eemente für die molekulare Klonierung mit der Selektion der Klone durch Blue/White-Screening enthält.

Commandes clavier:

= tourner,

= avant/arrière,

= faire défiler

ORI

Promotor

LacZ

MSC

amp-Resistenz

Erläutern Sie die Funktion der Elemente eines Plasmidvektors für die molekulare Klonierung (mit Selektion der Klone durch Blue/White-Screening).

Commandes clavier:

= tourner,

= avant/arrière,

= faire défiler

1)ORI - hier startet die Replikation des Plasmids. Ein effizienter Ori produziert viele Kopien des Plasmids.

2)Promotor - Signatsequenz => Startsequenz

3)LacZ -> das LacZ-Gen ist das Lac-Operon von E.coli. Es ist für das Blue/White-Screening esentiell. Wenn das Gen intakt ist wird ß-Galaktosidase hergestellt und ein blauer Farbstoff entsteht; die entsprechenden Zellen erscheinen blau. Falls das Gen aber durch ein Insert unterbrochen sein sollte wird der Farbstoff nict gebildet und die Kolonie erscheint weiß.

4)MSC = synthetischer DNA-Abschnitt, auf welchem sehr viele Schnittstellen für Restriktiondenzyme liegen. An dieser Stelle können Insert eingebaut werden.

5)amp-Resistenz - ist nötig für die Selektion der Bakterien, die das gewünschte Plasmid aufnehmen. Die Bakterien ohne Plasmid können sich auf einem 2amp.-Medium" nicht vermehren.

|) Welche Aussage über die Konformation von Pasmiden trifft NICHT zu?

Bei der Plasmidpräparation isoliert man vor allem die supercoiled Form des Plasmids

Plasmide liegen in der Zelle in der supercoiled Form vor.

Für die Klonierung werden Pasmide in die nicked circle Form überführt

Bei der Plasmidpräparation isoliert man vor allem die supercoiled Form des Plasmids

Plasmide liegen in der Zelle in der supercoiled Form vor.

Für die Klonierung werden Pasmide in die nicked circle Form überführt

||) Welche Aussage über die Konformation von Pasmiden trifft NICHT zu?

Auf einem Agarosegel kann man die nickled circle Form von der supercoiled Form unterscheiden.

In der supercoiled Form läuft das Plasmid auf einem Agarosegel nicht auf der Höhe, die seiner Länge bzw. Größe entspricht.

In der supercoiled Form läuft das Plasmid auf einem Agarosegel auf der Höhe, die seiner Länge bzw. Größe entspricht.

Auf einem Agarosegel kann man die nickled circle Form von der supercoiled Form unterscheiden.

In der supercoiled Form läuft das Plasmid auf einem Agarosegel nicht auf der Höhe, die seiner Länge bzw. Größe entspricht.

In der supercoiled Form läuft das Plasmid auf einem Agarosegel auf der Höhe, die seiner Länge bzw. Größe entspricht.

Die zur molekularen Klonierung verwendeten Bakterien unterscheiden sich von den ursprünglichen Wildtyp-Bakterien. Nennen Sie einen Laborstamm und beschrieben Sie drei Merkmale, die ihn von einem Wildstamm unterscheiden.

Escherichia Coli K12 - Derivate (z.B. E-coli XL1-Blue)

- keine Methylasen

- keine Recombinasen

- keine RE

Nennen Sie die Definition für "Plasmid".

= doppelsträngige, zirkuläre, (kleine [1000 - 20000bp]) extrachromosomale DNA

M3 Molekulare Klonierung

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