In vitro Mutagenese?
Methoden
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Kartei Details
| Karten | 13 |
|---|---|
| Sprache | Deutsch |
| Kategorie | Biologie |
| Stufe | Universität |
| Erstellt / Aktualisiert | 26.06.2016 / 29.06.2016 |
| Weblink |
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Was ist in vitro Mutagenese?
Der Einbau von Mutationen in ein Gen in vitro um die Auswirkung der Veränderung und somit die Funktion des Gens zu analsieren.
Wozu dient in-vitro Mutagenese?
- Durch die Wildtypanalyse kann man bestimmen, welche Funktion bestimmte Gene bzw. Proteine erfüllen
- Einfluss der Bindung auf einen Liganden kann bestimmt werden.
- Durch die Änderung der Proteine kann die Auswirkung auf die 3D-Struktur beobachtet werden und durch die 3D-Strukturänderung kann die Stärke der Bindung (z.B. zwischen einen Protein und einen Liganden) beeinflusst werden.
Welche Mutationen werden hauptsächlich verwendet?
Insertion
ein oder mehrere Basenpaare in die Sequenz eingebaut.
In der Natur geschieht das durch die Transposons und im Labor durch bestimme Methoden (wie zum Beispiel „Overlap Extension PCR Mutagenesis“).
Deletion
Verlust bzw. Löschung einer oder mehreren Basenpaare.
Diese kann zufällig oder gezielt erfolgen.
Welche Methoden zur In-Vitro-Mutagenes gibt es?
- Overlap Extension PCR Mutagenesis
- Error Prone PCR
- Site-Directed-Mutagenesis
- Alanine-Scanning
- Cystein-Scanning
- Random-Scanning
- Saturation Mutagenesis
Was is Overlap-Extension PCR Mutagenesis?
Für gezielte Insertion und Deletion = spezielle Punktmutationen
Wie wird eine Deletion mittels Overlap Extension PCr Mutagenesis eingeführt?
- 2 Primer (ein chimärer und ein nicht-chimärer)
- DNA wird in zwei Richtungen repliziert (PCR)
- Deletionsfragment nicht repliziert
- beiden neuen Fragmente überlappen sich
- die beiden Abschnitte werden mittels Ligase verbunden
- „neue“ DNA kann mittels PCR vervielfacht werden.
Wie wird eine Insertion mittels Overlap Extension PCR Mutagenesis eingefügt?
- DNA wird mittels 2 Primer repliziert
- Insertionsfragment wurde vorher so geschnitten, dass es mit den Enden der replizierten DNA überlappt
- mit Ligasen alle 3 Fragmente zusammen ligiert
Wie funktioniert die Error-Prone PCR?
bei zufälligen Mutationen von DNA Stücken ab einer Länge von mehr als 100 Basenpaaren hilfreich.
Verläuft wie eine normale PCR, bis auf das man eine ungenaue taq-Polymerase ohne Proof reading Funktion verwendet.
Die Mutierte Region wird daher über die Wahl des Primers festgelegt. Die meisten Mutationen sind dabei Punktmutationen.
Zur Erhöhung der Mutationen kann Mn2+ anstelle von Mg2+ verwendet werden.
Nachteil an dieser Methode ist, dass das verwendete DNA-Stück nicht zu lang sein darf.
Wie funktioniert die site-directed Mutagenesis?
Ein Plasmid wird mit 2 mutagenen Primern gekreuzt.
Während der erste mutagene Primer die gewünschte Mutation in die Zielsequenz einsetzt, eliminiert der zweite Primer, die Restriktionsschnittstelle im Plasmid („unique site elimination“ oder USE).
Es entstehen Plasmide, die einen mutagenen Strang und eine Wild-Typ Strang haben.
Wie werden die Klone bei der Site-directed-mutagenesis gescreent?
Die Plasmidpopulation besteht nun aus Wildtyp Plasmiden, jene die von den mutagenen Primern nicht als Template verwendet wurden, und Heteroduplex Plasmide (ein elterlicher Wildtyp Strang und ein neuer mutagener Strang (ohne Restriktionsschnittstelle).
Das Plasmid-Gemisch wird mit einem Restriktionsenzym versetzt, wobei nur die Wildtyp Plasmide geschnitten und linearisiert werden, da die mutagenen Plasmide vor einem Verdau resistent sind.
Der Mix aus Linearem Wildtyp und ringförmigen Heteroduplex wird nun in E.coli transformiert und kultiviert.
Es replizieren sich ausschließlich nur Heteroduplexe, da lineare DNA 100000-mal schlechter transformiert als ringförmige.
Ergebnis der ersten Replikation: Ein Wildtyp-Plasmid, dass noch eine Restriktionsschnittstelle trägt und ein mutagenes Plasmid ohne Schnittstelle.
Diese Generation wird ein zweites Mal mit demselben Restriktionsenzym versetzt, um die
Wildtyp Plasmiden zu linearisieren.
Wiederholte Transformation in einen E. coli Stamm diese Form von Selektion garantiert, dass viele der daraus resultierenden Transformanten, die gewünschte Mutation enthalten.
Wozu dient Alanin-Scanning?
Die geladenen Seitenketten, die bevorzugt an der Oberfläche eines Proteins auftreten, werden durch Alanin ausgetauscht.
Die geladenen Seitenketten spielen vor allem bei Oligomerisation, Katalyse sowie bei der Bindung von Liganden eine wichtige Rolle.
Der systematische Austausch aller geladenen Seitenkette an der Oberfläche eines Proteins stört die Funktion der Aminosäuren, aber die Konformation des Proteins bleibt unverändert. Auf diese Weise können Funktionen den einzelnen Aminosäuren zugeordnet werden.
Wozu dient Cystein-Scanning?
Ungeladene und hydrophobe Seitenketten werden durch Cystein ersetzt.
Da Cystein gut mit Reagenzien wie N-Ethylmaleinimid reagiert, können daraus Auswertungen erfolgen. Das Cystein-Scanning gibt dabei Aufschluss auf die räumliche Struktur sowie auf die Zugänglichkeit der Seitenketten.
Wie funktioniert Saturation Mutagenesis?
Mittels Restriktionsenzymen wird ein Codon aus dem Gen ausgeschnitten. In diese „Lücke“ wird dann ein Mutanten-Codon hinein platziert.
Dieser Mutanten-Codon wurde zuvor „zu Recht“ geschnitten und es blieben Überhänge.
Die Überhänge werden dann für Ligation gebraucht um das neue, fertige Sequenz anzufertigen.
Als Ergebnis erhält man andere Aminosäure im Protein.
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