Histologie
Lernkarten für das Fach Histologie an der Medizinischen Universität Innsbruck
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Lernkarten
Was für eine Schnittdicke hat ein Präparat für das Lichtmikroskop?
weil sie druchstrahlbar sein müssen dürfen 7-10µm nicht überschritten werden
Welche Möglichkeiten einer Herstellung histologischer Präparate gibt es?
1. Ausstrichpräparat: Blut
2. Isolations-, Zupfpräparat: mit Nadel wird ein Präparat zerzupft, sodass es ganz dünn oder chemisch zersetzt wird
3. Häutchenpräparat: dünne, durchstrahlbare Häutchen
4. Schnittpräparat: dünn geschnittene Scheiben eines Präparates (am häufigsten verwendet)
Wie werden Präparate haltbar gemacht? Und warum?
Durch Fixations-/Färbungsvorgänge;
1. um Autolyse und Fäulnis zu verhindern
2. um die Festigkeit zu erhöhen -> Härtung
3. die Färbbarkeit zu erhöhen
Herstellung eines histologischen Präparates
1. Entnahme des Gewebes
2. Fixierung des Präparates
3. Einbettung der Probe
4. Dünne Schnitte anfertigen
5. Schnitt auf Objektträger legen, strecken
6. Färbung
7. Deckglas auf gefärbtes Präparat geben
Wie wird ein zu untersuchendes Gewebe entnommen?
entweder durch Biopsie oder direkt aus der Leiche,
sollte möglichst klein sein (1,5 x 1,5 x 1,5) -> Fixation geht schneller
Präparat liefert immer nur Momentaufnahmen
Was geschieht bei der Fixation?
die meisten Präparate werden durch eine Mischung fixiert,
Proben werden durch die Manipulation mit den Fixierungsmitteln bis zu 30% kleiner,
sie können nicht mit lebenden Zellen verglichen werden
-> weil aber alle gleich behandelt werden können diese sehr wohl verglichen werden!
Welche verschiedenen Fixationen gibt es?
1. Immersionsfixierung: Gewebeprobe in Fixierungsmittel einlegen und warten, bis Flüssigkeit die Probe durchzogen hat (durch Bewegung beschleunigt)
2. Perfusionsfixierung: funktioniert über das Kapillarsystem der Probe -> ist schneller aber aufwendiger
3. Fixierung durch verschiedene Stoffe: Aldehyde, Alkohole, organische Säuren, Schwermetallsalze
Wie funktioniert die Fixierung durch Aldehyde?
(bewirken Gelatbildung)
Formaldehyd: gasförmig, wird zu 38-40% in Wasser gelöst, wird 4-10%ig in der Histologie verwendet -> verdünnt Pufferlösung oder Leitungswasser;
Formalin = nicht das beste Mittel, zerstört aber am wenigsten;
Glutardialdehyd (Elektronenmikroskop)
Welche verschiedenen Alkohol-Fixierungen gibt es?
(Wasserentzug)
1. Methanol (selten verwendet, da sehr giftig)
2. Ethanol (teuer, kann wegen Verdunstung nur 98%ig verwendeet werden)
3. Isopropanol (geht 100%ig in Lösung, ist nicht teuer)
Welche verschiedenen Fixierungen mit organischen Säuren gibt es?
(werden immer verdünnt verwendet, ansonsten wird etwas zerstört)
1. Essigsäure: CH3COOH fixiert durch Verschiebung des pH-Wertes -> Denaturierung
2. Pikrinsäure (auch Sprengmittel)
Was passiert beim Einbetten der Probe bei der Fixierung?
Probe wird meist in Paraffin, aber auch Kunststoff oder Celloidin gebettet:
1. Auswaschung mit Wasser, um Fixierungsmittel zu entfernen
2. Wasserentzug mit aufsteigender Alkoholreihe
3. Alkoholentzug mit Methylbenzoat -> entzieht auch Restwasser
4. Menthylbenzoat mit Chlorophorm (früher Benzol, aber giftig)
5. Präparat wird in Paraffin gegeben (Chlorophorm löst sich darin)
6. Präparat wird in Paraffinschälchen in den Paraffinofen gegeben
7. Präparat wird in eine Form gegeben und mit Paraffin übergossen (schöne Seite nach unten)
Wie wird das Präparat geschnitten?
Schnittblock wird in Schlittenmikroskop gegeben, dieses fertigt dünne Schnitte an:
- 7 - 10 µm für das Lichtmikroskop (LIMI)
- 0,5 - 1 µm dicke Präparate werden als semidünne Schnitte bezeichnet
- 30 - 100 nm sind ultradünne Schnitte für das Elektronenmikroskop (EMS)
Wie wird der Paraffinschnitt auf dem Objektträger gelegt und fixiert?
- mit Hilfe eines nassen Pinsels
- Schnitt muss erst gestaucht und gestreckt werden: Eiweisglyzerin auf Objektträger, Wasser auf Eiweis -> Streckung bei 40°C (24h im Wärmeschrank bis Eiweis fest koaguliert ist
Wie wird das Präparat gefärbt?
- Paraffinreste werden mit Xylol entfertn
- Xylol wird dann mit absteigender konzentrierter Alkoholreihe entfernt
Wie wird das Deckglas auf dem Präparat fixiert?
- wird mit Eindickmedium mit gleichem Brechungsindex wie Glas versiegelt
-> früher wurde Kanadabalsam verwendet, heute Kunststoffe (Entellan oder Eukitt)
-> Ergebnis: planparallele Platte mit histologischem Präparat
Was bedeutet H.E. Färbung?
H ... Hämatoxilin (Präparat wird Rot -> unter Leitungswasser gehlaten wird es blau -> gebläut
E ... Eosin (Präparat wird in eine aufsteigende Alkoholreihe gegeben -> Wasserreste entfernen)
Welche 2 verschiedenen Färbungsarten gibt es?
- Sukzessivfärbung: mit einer Farbe
- Simultanfärubng: mehrere Farben
Welche verschiedenen Blutfärbungen gibt es?
panoptische Färbung (Pappenheim - Färbung) -> Simultan-Sukzessiv-Färbung:
1. May - Grünwald - Färbung (Methylenblau, Eosin)
2. Auswaschung
3. Giemsa - Färbung (Methylenblau, Eosin, Azur)
Wie werden Bindegewebsflächen gefärbt?
Azanfärbung: Azokarmin (rot) und Anilinblau -> kollagene Fasern werden blau
Was ist die Gefrierschnittmethode und wie funktioniert sie?
- wird verwendet wenn schnelles Untersuchungsergebnis gebraucht wird (Tumoroperation)
- Probe wird zum Teil in Paraffin gegeben, zum Teil eingefroren -> Präparat kann zerschnitten werden
- durch Kristallbildung können Zellen zerstört werden, wie bei Fixierungsmitteln viel verändert wird (Fettauflösung durch Alkohol)
- nach Schnellfärbung kann Präparat betrachtet werden
- weitere Möglichkeit: Gefriertrocknung: Wasserentzug im getrockneten Zustand
Wie funktioniert Polarisationsmikroskopie?
Lichtwellen werden durch anisotrope Strukturen (Kollagen) gedreht -> dadurch wird Ebene des Lichtes gedreht
Was kann nach einer Biopsie gemacht werden?
- Zellen können in Kulturen gezüchtet werden -> die Toxizität von Substanzen kann so geprüft werde
- HELA - Zellen (bestimmte Karzinome, die nicht altern) sind wichtig für Forschung
Was ist die Vitalmikroskopie und wie funktioniert sie?
= Mikroskopie am lebenden Organismus nach Vitalfärbung
Was ist die Vitalfärbung?
ungiftiger Farbstoff wird injiziert -> Zellen, die zur Phagozytose fähig sind, nehmen diesen Farbstoff auf und geben ihn erst nach längerer Zeit wieder ab
Was ist die Autoradiographie?
- radioaktiver Stoff wird dem Organismus zugeführt, der sich im Körper wie ein normaler Stoff ablagert
-> auf "radioaktives" Organ wird eine Fotoplatte gelet, die vom radioaktiven Stoff geschwärzt wird
Welche Eigenschaften hat das Transmissionselektronenmikroskop?
- sehr kleine Wellenlänge und sehr hohe Auflösung (0,1 nm), aber nur in schwarz-weiß möglich
- Vergrößerung zwischen 40.000 und 200.000 fach
- Präparate müssen so dünn sein, dass die korpuskuläre Strahlung durchgeht
Eigenschaften eines Rasterelektronenmikroskop?
- funktioniert wie Lupe, verwendet zur Oberflächenbetrachtung
- Elektronenstrahl wird reflektiert und von einem Detektor aufgezeichnet -> Projektion auf Monitor
- Problem: Präparate laden sich elektrisch auf (werden durch Gold-Palladium-Schicht leitend gemacht9
- weil im Vakuum betrachtet -> Präparate müssen ganz trocken sein
Wozu dient die Feulgen'sche Reaktion?
- zum Nachweis von DNA bzw. RNA
- DNA ist Feulgen-positiv
- RNA ist Feulgen-negativ
-> so können auch Viren nachgewiesen werden
- Nachweis erfolgt mittels Schiff'schem Reagenz (= Fuchsin = schwefelige Säure), wird in Verbindung mit OH-Gruppe rot (Nachweismethode für Aldehyde)
Was ist die PAS-Reaktion? Wozu dient sie?
PAS: periodic acid Schiff-reaction
- dient zum Nachweis von Kohlenhydraten (Glykogen, Glykolipide, Glykoproteine) -> sind PAS-positiv
- Proteoglykane sind PAS-negativ
Erklärung: Periodsäure legt eine OH-Gruppe frei, die mit dem Schiff'schen Reagenz nachgewiesen wird
Wie werden Enzyme nachgewiesen?
über ihre spezielle Wirkung
Wie werden Fette nachgewiesen?
- keine histochemische Reaktion, sondern Färbung mit Sudanfabstoffen wie Sudan III (rot)
- Farbdarstellung gelingt nur mit Gefrierschnitt, der in Glyzerin-Gelatine (Kollagen) eingebettet wurde
- mit Sudan-Schwarz gelingt eine schwarz-weiß Färbung, da das OsO4 (Oxid) an die Fettsubstanzen bindet und sie färbt (da es ein Metall ist, auch gut für Elektronenmikroskop)
Welche ist die größte menschliche Zelle?
menschliche Eizelle (120µm)
Welches sind die kleinsten lebensfähigen Zellen?
Lymphozyten (weiße Blutzellen) (4-6µm)
Wie groß sind Bakterien'?
900 nm - 4 µm
Wie groß sind Viren?
10 - 100 nm
Wie groß ist die Zytomembran?
6 - 10 nm
Wie groß sind Proteine (Ribosomen, Filamente)?
2 - 10 nm
Wie groß sind Aminosäuren?
ca. 1 nm
Wie groß sind Atome?
0,1 - 0,5 nm
Welche größen sind mit Lupe oder Lichtmikroskop, Elektronenmikroskop und Spektroskopie erkennbar?
- Lupe oder Lichtmikroskop: bis 10 µm
- Elektronenmikroskop: bis 0,1 nm
- Spektroskopie: kleiner als 0,1 nm
