Genbanken

• DNA aus Gewebe isoliert
• geeigneter Vektor ausgewählt
• DNA in kürzere Fragmente zerschnitten (RE) (dürfen Aufnahmekapazität des Vektors nicht überschreiten, sonst nicht aufgenommen und später in der Bank nicht vorhanden
• DNA mit dem Vektor ligiert
• in λ-Phagenköpfe verpackt oder durch direkte Transformation  Vektor mit der DNA in den Wirt eingebracht.

Danach kann die Bank zur Identifikation eines gewünschten Klons gescreent oder für die Langzeitlagerung amplifiziert werden.

• Lambda oder Cosmid Vektoren (Phagen 10-20 kb inserts, Cosmide 30-40
  kb)
  • hohe Klonierungseffizienz
  • relativ große Fragmente aufnehmen
• Yeast artificial chromosome Vektoren (in Hefezellen)
  • 0.3 bis 1.2 Mb genomischer DNA

Die Schwierigkeit bei der Herstellung von DNA Banken besteht darin, sicherzustellen, dass zumindest eine Version jeder Sequenz von Interesse enthalten ist.

Wenn das Zielfragment zuvor gereinigt werden konnte, kann die Gesamt-Klonanzahl reduziert werden (z.B. bei subgenomischen DNA-Banken).

Sie beinhaltet lediglich jene DNA, die komplementär zur vorhandenen mRNA im untersuchten Zell- oder Gewebetyp ist. Dies sind also nur jene mRNAs, die gerade in der Zelle aktiv sind. Je häufiger die jeweiligen Gene abgelesen und transkribiert werden, desto häufiger ist dann auch die cDNA in der Bank vertreten.

Weil nur rund 5% der gesamten RNA einer Zelle mRNAs sind, werden diese angereichert, damit sie im Verhältnis zu anderen RNAs (ribosomale RNAs, etc.) häufiger in der cDNA Bank vorkommen.

Außerdem enthalten cDNA Banken nur solche mRNAs, die ein Poly(A)-Tail besitzen. Kurzlebige mRNAs (z.B. Histon mRNAs) haben kein Poly(A)-Tail und sind deshalb in cDNA Banken nicht vorhanden.

• gesamte isolierte RNA auf einem speziellen Medium inkubiert.
• An diesem Trägermix (z.B. Agarose) sind Oligo(dT)-Primer gekoppelt.
• An diese Oligo(dT)-Polynukleotide lagern sich all jene RNAs an, die ein Poly(A)-Tail besitzen
• Die anderen RNAs können eluiert werden.
• aus der gereinigten mRNA DNA gemacht werden.
• Dazu wird das Enzym Reverse Transkriptase eingesetzt. Diese braucht, wie jede Polymerase, einen Primer
• zwei verschiedene Primer eingesetzt
  • Oligo(dT) Primer (zu jeder mRNA eine einzige vollständige cDNA synthetisiert werden
  • zufälligen Hexamer-Primern (jede mögliche Kombination ist vorhanden), binden irgendwo an die mRNA, weshalb die cDNA meist in mehrere Stücke zerteilt synthetisiert wird. Ein weiterer Nachteil dieser Primer ist, dass sie nicht auf mRNA spezifisch sind.
• cDNA muss jetzt noch mit einer DNA-Polymerase doppelsträngig gemacht werden.
  • Die 5‘ Enden der mRNAs sind allerdings alle unterschiedlich, was das Finden eines passenden Primers erschwert.
  • mRNAs mit einer RNAse teilweise abbauen, damit die Polymerase an den so entstehenden freien 3‘ OH Enden die Synthese beginnen kann. Diese cDNA enthält aber nicht mehr die vollständige Sequenz
  • vor der cDNA-Synthese ein Oligonukleotid bekannter Sequenz an das 5‘ Ende der gereinigten mRNAs zu ligieren. Ein zu diesem Oligonukleotid komplementärer Primer kann dann für die Doppelstrangsynthese mittels PCR eingesetzt werden. Mit dieser Methode ist die entstehende Sequenz vollständig.
• Vor der Ligation der cDNA mit dem ausgewählten Vektor müssen schließlich noch Linker an die Enden der cDNA ligiert werden, die der jeweiligen Restriktionsschnittstelle entsprechen.

Vortiele durch Analyse von mRNA

• Es kann unmittelbar auf die AS Sequenz des Proteins geschlossen werden
• hnRNA (unprozessierte präRNA) kann udrch alternatives splicen zur Entstehung unterschiedlicher Varianten eines Proteins führen. Für Identifizierung dieser Varianten muss mRNA analysiert werden
• cDNA kann zur in-vitro und in-vivo Herstellung des Proteins verwendet  werden (bei genomischea auf Grund von Exons/Introns nicht möglich, Prokaryoten können nicht splicen)

• RNA ist im  Vergleich zur DNA instabil, im basischen ins OH am C2 der Ribose eine Schwachstelle
• Alle Organismen Enzyme zum effektiven Abbau von RNA (Regulation der Genaktivität, Schutz gegen RNA-Viren). (mRNA möglichst gleich nach der Isolierung weiterverarbeitet oder schockgefroren werden.)
• Die Analyse von RNA ist recht kompliziert, da viele molekularbiologische Methoden nur für DNA geeignet sind
• Der Anteil einer bestimmten mRNA an der gesamt-mRNA ist variabel und hängt von Gen, Gewebe, Stadium und Differenzierung des Organismus ab, Für cDNA Banken ist die Bestimmung der zu screenenden Klonanzahl daher schwieriger, weil nicht genau bekannt ist, wie viel von der Zielsequenz von Anfang an vorhanden war. Die Menge des entsprechenden Proteins im untersuchten Gewebe ist oft ein guter Indikator für die Menge an mRNA.

Nicht nur kodiert sondern auch exprimiert

Der verwendete Vektor muss für die Wirtszelle geeignet sein. Der Expressionsvektor beinhaltet einen regulierbaren Promotor mit Transkriptionsstart und ein Startcodon für die Translation. Oft wird das Zielprotein als Fusionsprotein mit einem anderen Protein exprimiert (in E. coli z.B. β-Galactosidase).

Der Fusionspartner dient zur selektiven Isolierung und wird dann entfernt.

• Ob eine genomische oder cDNA Bank zum Screening herangezogen werden muss, hängt davon ab, ob für die nachfolgende Analyse das gesamte Gen mit codierenden und nichtcodierenden Abschnitten oder die mRNA Sequenz benötigt wird.
• Die Güte der Genbank sollte ebenfalls bei der Auswahl berücksichtigt werden. Diese wird einerseits von der Klonzahl in der Bank, andererseits von der Größe der Fragmente bestimmt.
• Außerdem spielt die Ausgangsqualität der DNA eine große Rolle. Je besser die DNA gereinigt wurde, desto besser. Bei zu geringer Qualität kann es vorkommen, dass das gesuchte Fragment gar nicht in der Bibliothek enthalten ist. Fragmente können auch verlorengehen, wenn die Bibliothek oft amplifiziert wurde und bei der Amplifikation manche Sequenzen nicht mitgenommen werden. Jedenfalls muss die Genbank eine größere Anzahl von Klonen umfassen, als die Anzahl der Klone, die den Schätzungen zufolge gescreent werden müssen, um den gesuchten Klon zu identifizieren.

• GENOMFORSCHUNG DURCH MUTATIONEN
  Funktion von codierenden Sequenzen durch Einführung von Mutationen und Analyse der Auswirkungen.
  Das Resultat ist eine Genbank, in welcher die verschiedenen Varianten der zur untersuchenden Gensequenz vorliegen und gleichzeitig untersucht werden können.
  Eine andere Verwendungsform einer solchen „Bibliothek“ ist der Erhalt von Genomen von Nutzpflanzen, die im Rahmen der ständigen Kultivierung dem künstlichen Selektionsdruck zum Opfer fallen. Hier gilt es dem Verlust von Genen entgegenzutreten.
• ANNOTIERUNG IN BIOINFORMATIK UND FORSCHUNG
  Genbibliotheken bieten zudem eine Arbeitsgrundlage für Screeningverfahren, insbesondere Sondierungsverfahren, in der Forschung von Bioinformatikern, welche die Funktionen von Genen untersuchen und sie entsprechend zuweisen. Dieser Vorgang nennt sich Annotierung. Wenn man die Sequenz und die Funktion eines Gens kennt, lassen sich in weiterer Folge Ähnlichkeiten und homologe Sequenzen zwischen Spezies leichter bestimmen. Somit können Stammbäume präzisiert werden und zu einem besseren Verständnis der Arten führen
• PHARMAKOGENOMIK
  Der Bereich der Pharmakogenomik beschäftigt sich mit den spezifischen Reaktionen eines Individuums mit Arzneistoffen. Da jeder menschliche Körper anders auf Medikamente reagieren kann, wäre es in der zukünftigen Behandlung von Patienten von großer Bedeutung mögliche Nebenwirkungen im Vorhinein zu reduzieren oder gar zu eliminieren. Mit Hilfe von Genbanken könnten Patienten im Krankheitsfall eine auf sie persönlich zugeschnittene medikamentöse Behandlung erhalten, mit niedrigerer Unverträglichkeit und erhöhtem Wirkungsgrad.