Fluoreszenz

Die Stokes Shift beschreibt die Verschiebung der Wellenlänge der Energie
zwischen der Absorption und der Emission. Das Emissionslicht ist sowohl
längerwelliger als auch energieärmer, da die emittierte Energie nicht nur durch
Licht sondern auch durch Wärme abgegeben wird.

Fluorochrome sind Moleküle, die spezielle Wellenlängen des Lichts absorbieren
und dieses dann mit längerer Wellenlänge wieder emittieren. Das Licht- bzw. das
Farbspektrum sind kennzeichnende Eigenschaften eines jeden einzelnen
Fluorochromes.

Primärfluoreszenz oder auch Autofluoreszenz ist die moleküleigene Fluoreszenz.
Sie tritt bei geeignetem Anregungslicht von sich aus auf, ohne dass man speziell
Farbstoffe einsetzten muss. Am häufigsten findet man Primärfluoreszenz bei
Molekülen mit konjugierten Doppelbindungen

Die Sekundärfluoreszenz wird verwendet um Strukturen ohne Primärfluoreszenz
im Fluoreszenzmikroskop sichtbar zu machen. Hierzu muss man die Strukturen
mit speziellen und unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen färben. Dies nennt
man Fluorochromierung.

Zunächst wird mittels des Anregungsfilters bzw. Excitation Filters nur das
Licht der gewünschten Wellenlänge aus dem Licht der Lichtquelle ausgesondert. Nach dem Objekt wird das restliche Licht nochmals gefiltert mit Hilfe des Sperr- oder Barrierefilters. Damit wird noch das übrige Licht der Lichtquelle herausgefiltert, sowie nur eine bestimmte Wellenlänge und somit Farbe. Nur dadurch überstrahlt das Anregungslicht nicht mehr das, der Emission und die einzelnen Strukturen werden im Mikroskop sichtbar.

• Auflicht
• Hellfeld
• Dunkelfeld

• DAPI
• Cy3, Cy5
• GFP

4‘,6-Diamido-2-phenylindol.

Es färbt den Zellkern (DNA) blau bei einem Absorptionsmaximum von: 358 und einem
Emissionsmaximum von 461nm.

AT-reiche Sequenzen

unspezifisch: jeden Organismus & keine lebend-tot unterscheidung

DAPI ist in der Lage, intakte Zellmembranen zu durchdringen, jedoch nur sehr
langsam. Daher ist die Intensität in lebenden Zellen meist geringer. Des Weiteren
ist es toxisch und mutagen.

Cyani- Farbstoffe.

Cy3 färbt grün bei einem Anregungsmaximum von550 nm und einem Emmissionsmaximum von 570 nm. Cy5 färbt rot bei einem Anregungsmaximum von 650 nm und einem
Emissionsmaximum von 670 nm.

Visualisierung und Quantifizierung benutzt, als auch für RNALokalisation.

Beide Cyanide haben eine NHS-Estergruppe, welche nur mit aliphatischen
Aminen binden. Daher müssen die Nukleotide vorher mit Amynoallil-Gruppen
synthetisiert werden (jede 60. Base).
Für die Proteinfärbung haben Cy3 und Cy5 Maleimide reaktive Gruppen, die mit
Sulfhidryl-Gruppen von Cysteinde binden. Cysteine können mittels PCR addiert
werden

green fluorescence protein, aus pazifischen Qualle (Aequorea victoria)

GFP besteht aus einem b-barrel bestehend aus insgesamt 11
Faltblättern. In der Mitte findet sich eine α-Helix welche das
Chromophor einbettet. Das Chromophor setzt sich aus einem
Triplet zusammen: Serin-65, Tyrosin-66, Glycin-67.

Tyr66 kann in einer Hydroxy-Form vorliegen (Anregung bei 395nm) oder in
Enolat-Form – deprotoniert (Anregung bei 470nm)

1. Anregung (395 nm) – Erhöhung des Säurecharakters des Tyrosin
2. Abspaltung des Wasserstoffes
3. Fluoreszenz in grün – Anregung bei 470nm
4. Emission bei 509 nm
5. Protonierung des Fluorophores

• hohe Stabilität
• pH-Berich von 5-12
• Temperaturen bis 65°C
• Stabil gegenüber den meisten Proteasen (Trypsin, Elastase)
• Stabil in 8 M Harnstoff, 4 M Guanidin/HCl
• Fusion N- und C-Terminal ohne das Fluoreszenzpotential verloren geht

• Maskierung von Signalsequenzen für Transport in bestimmte Teile der Zelle (z.B. Golgi)
• Keine Aussage über Position der Proteine
• Leicht inhibierender Effekt der Zellteilung
• Großes Molekulargewicht in Vergleich zu anderen Fluoreszenzfarbstoffen
• Langsame Chromophorbildung (bis zu 2 Stunden)
• Über 20°C Bildung inaktiver Formen
• geringere Fluoreszenzintensität

Timer
FPs die mit der Zeit die Farbe ändern je nachdem wie es modifiziert wird bei seinem Lebenszyklus in der Zelle. Sie dienen der Analyse von Prozessen in der Zelle.
Beispiele:

• DsRed-E5: grüne Fluoreszenz über mehrere Stunden nach der Synthese, später färbt es sich rot
• mCherry-based timers: Färbung von blau zu rot in einer Dauer von bis zu einem Tag

Analyse der Promotorakivität
FPs welche als Indikator der Promotoraktivität dienen.
Sie werden downstream des Promotors hinein geklont und zeigen somit die Promotoraktivität in bestimmten genetischen Umgebung an. Eine gleichzeitige, farbliche Darstellung von mehreren Promotoren mit unterschiedlichen FPs verschiedener Emissionswellenlängen ist möglich.

= Förster Resonanz Energie Transfer oder Fluorescence Resonance Energy Transfer

• Zeitliche und räumliche Information über Nachbarschaft von Biomolekülen
• Information über räumliche Veränderung in Biomolekülen
• Messung der Interaktion intrazellulärer Molekülgruppen in lebenden Zellen

Energie wird von einem Donor-Molekül auf ein Akzeptor-Protein strahlungslos übertragen

-> Die Emission des Donors wird reduziert, während die des Akzeptors erhöht
wird

FRET ist messbar
Förster-Radius: Abstand zweier Moleküle bei dem die Energieübertragung mittels FRET 50% Effizienz stattfindet

Fluorescence Recovery after Photobleaching

• Messung der Beweglichkeit von Biomolekülen

Interessierendes Molekül mit Fluoreszenzmarker versehen, Fluoreszenzintensität wird an einer bestimmten Position vermessen

am gleichen Ort wird die Fluoreszenz durch einen Laserpuls, in der Anregungswellenlänge des Fluoreszenzfarbstoffs, zerstört = Bleichvorgang (Fluoreszenz irreversibel zerstört)

-> schwarzer Bereich --> zerstörte Moleküle „gehen“ weg

Moleküle aus Umgebung diffundieren in gebleichten Bereich (aktiver Transport: gerichtete und schnelle
Wanderung) -> erneut fluoreszierende Moleküle in diesem Bereich

Diffusionszeit kann durch die Messung der Fluoreszenzintensität bestimmt werden (je länger es dauert, dass die ursprüngliche Intensität erreicht wird, desto langsamer die Diffusion)

Gemessen wird der Grad der Sättigung im Verhältnis zum Signal, dass vor
der Zerstörung gemessen wurde

Durchflusscytometrie ist eine Methode, um verschiedene physikalische und chemische Eigenschaften von einzelnen Zellen oder Teilchen in Suspension zu messen (Cytometry), während sie jeweils einzeln durch einen Flüssigkeitsstrom transportiert an einem Messpunkt vorbeifließen (flow).

Der Vorteil dieser Technik ist die simultane, quantitative Bestimmung mehrerer Parameter (z.b./ u.a. Oberflächenmarker, größe, granularität) von sehr vielen Zellen in kurzer Zeit(=> bis zu mehreren Tausend (70000)Zellen pro Sekunde!!!).

• fluidics system
  => transportiert die einzelnen partikel in einem strom zur Messeineinheit (Laserstrahl)
• optics system
  => besteht aus einer lichtquelle, die einzelne partikel/zellen anstrahlt & aus optischen spiegeln und filtern, die das erhaltene lichtsignal zur richtigen auswertenden Einheit (detektor) lenken
• electronics system
  wandelt die detektierten Lichtsignale in elektronische Signale um, die vom Computer als Daten erfasst und gespeichert werden können.

• Zellen müssen so preparier werden, dass sie in einer Einzel-Zell-Supsension vorliegen
• hydrodymanische Fokussierung
  • Zellsuspension angesaugt
  • in der flow cell durch eine sehr kleine Öffnung (zwischen 50-100μm) in die
    Mitte eines äußeren flüssigkeitsstroms =sheath fluids injiziert
  • Probenstrom nicht mit dem sheath fluid vermischt (=>laminar flow genannt)
  • Stattdessen beschleunigt der äußere, schneller fließende sheath fluid die Zellen und komprimiert die Probenflüssigkeit zu einem sehr engen zentralen Strahl innerhalb
    des sheath fluids.
  • Zellen so präzise positioniert und damit genau durch ein ebenfalls fokusierte Lichtstrahl geführt werden, was eine genaue Messung ermöglicht
• Lichsystem
  Wenn der Laserstrahl auf die vorbeifließende Zelle trifft, wird das
  Licht durch die Zellen in alle Richtungen, also kleinwinkelig und
  großwinkelig abgelenkt, ohne die Wellenlänge des Lichtes zu
  verändern.
• Filter
  Das Streu-und Fluoreszenzlicht wird dann durch Linsen gebündelt.
  Eine Kombination aus einem dichroide Spiegel und einem Bandpass-
  filter, (nur bestimmte wellenlängen durchgelassen) sind dafür
  verantwortlich das gesuchte Wellenlängenspektrum zu isolieren und
  zum richtigen Detektor zu lenken. Diese Trennung von
  Wellenlängen ist notwendig, weil Detektoren „farbenblind“ sind,
  photonen unterschiedlicher wellenlängen nicht unterscheiden
  können.

• FSC
  Das vorwärts Streulicht ist ein Maß für die Beugung des einfallenden Laserstrahls im flachen winkel (0.5-10°) und ist proportional zum Volumen/Größe der Zelle.
• SSC => side scatter=right-angle light
  Das seitwärts Streulicht ist ein maß für die Brechung des Lichtes im rechten Winkel (90°) an der Oberfläche und an inneren Strukturen die von der Granularität der Zelle und der internen Komplexität der Zelle bestimmt wird.
• Fluoreszenz
  biologische Informationen über eine Zelle (DNA/RNA-Menge, Proteinmenge,...)

• Photodiode
  entlang der Achse des Laserstrahls und wandelt es in ein elektrisches Signal (Spannung!) um. Eine physische Barriere (beam absorber) vor dem Detektor verhindert, dass das Laserlicht selbst aufgezeichnet wird, durch Blockierung des Lichts in einem Winkel von bis zu 2° der Laser achse.
• Photomultipliertubes
  im rechten Winkel zur Laser-Achse
  PMT registrieren einfallende Photonen des SSC und Fluoreszenzlicht, übersetzten sie ebenfalls in elektrische Signale und amplifizieren das Signal dabei. Sind sehr empfindlich.

Der in beiden Fällen generierte Spannungspuls ist dabei von der zahl der photonen (=intensität) abhängig.

= Fluorescence activated cell sorting

Zellen können nicht nur analysiert werden, sondern auch nach
vorher festgelegten Eigenschaften sortiert werden. Dazu verwendet
ein FACS-Gerät (Fluoreszenzaktivierter Zellsortierer=>engl.
fluorescence-activated cell sorter), das auf einem Flow cytometer
basiert.

Stream-in-air sorter
= elektrostatische Sortierung.
Sie beruht auf der elektrostatischen Aufladung und Ablenkung von kleinen Tropfen, die (im idealfall) eine einzelne Zelle enthalten, während sie ein elektrisches Feld durchqueren.
Der Zellstrom wird, nachdem die verschiedenen Parameter erfasst wurden, in die Luft entlassen und zerlegt sich in kleine Tropfen.
Durch eine Vibration (von einem transducer generiert) mit genau definierter, konstanter, hoher Frequenz, ist es möglich die Tropfenbildung so zu stabilisieren, dass tropfen gleicher größe und in regelmäßigem abstand entstehen. So kann der Abstand und die Zeit zwischen der Passage am Laser und dem Punkt der Abspaltung des Tropfens (break-off point) berechnet werden. Am break-off point erfolgt die elektr Aufladung der Tropfen, abhängig von den vorher detektierten Eig der eingeschlossenen Zelle. Die tropfen
passieren im anschluss ein elektrisches feld zwischen zwei entgegengesetzt polarisierten platten und werden abhängig von ihrer ladung nach links oder rechts oder gar nicht abgelenkt und in verschiedenen tubes gesammelt. Eine stream-in-air sorter kann Zellen mit einer Geschwindigkeiten von bis 30.000/s sortieren.

Mechanischer Sorter
durch ein rotierendes catcher tube, das die zellen die einen interessieren aufsaugt. Bis zu 300 zellen können so pro sekunde sortiert werden,
allerdings kann man nur eine population und nicht mehrere parallel damit isolieren. Vorteil: keine tropfen werden gebildet und gesamter prozess in geschlossener umgebung, sodass keine aerosole mit potenziell gefährlichen proben entstehen können.

• Färbung von Substraten macht Enzymaktivität sichtbar
• gefärbte Membranen lassen auf Zellproliferation schließen
• Genombibliotheken können sortiert werden
• Sortierung von lebenden Tieren (c. elegans Larven) durch Umbau für die größeren Tiere (im Vergleich zu den Zellen)