Ergänzende Molekularbiologie

Prokaryoten

• Erkennen des Missmatches: DAM-Methylierung --> fehlerhafte Strang ist nicht methyliert
• Korrigieren des Missmatches: MutS bindet an dsDNA und macht proofreading
  • Mismatch erkannt --> Rekrutierung weiterer Proteine
    • unter ATP-Verbrauch
    • MutH, eine Endonuclease; schneidet neu synth. Strang vor dem Mismatch (macht nick)
    • Schnitt nur möglich, wenn in direktem Kontakt mit MutS --> entsteht loop (wenn MutS+H weit entfernt)
  • nick erkannt --> entfernen DNA von nick bis zu bump und damit des fehlerhaften Nukleotids
    • 3'5'-Exonucleasen oder 5'3'-Exonucleasen, je nach Ausrichtung von MutS und MutH
  • Pol-III: füllt Lücke, dieses mal richtige Basenpaarung

Eukaryoten

• leading strand: Fehler wird erkannt und gewisse Proteine rekrutieren Exo-I --> Ausschneide fehlerhaften Abschnittes und Umgebung --> DNA-Polymerase
• lagging strand: nicks vorhanden, fehlerhafte DNA einfach für Exonucleasen zugänglich.

Nukleotide können auf vielen Wegen (Hydrolyse, Oxidation, Alkylierung, Deamination) modofiziert werden. Gefählich sind Veränderungen, die in DNA natürlich vorkommende Basen erzeugen. Veränderungen, die fremde Basen erzeugen werden erkannt und sind weniger tükisch.

• Thymin-Dimer Bildung über UV-Strahlung
  • zwei Thymin-Basen verbinden sich zu Cyclobutandimer --> DNA wird unbrauchbar
  • Reparaturmechanismus: Photolyase
    Lyase löst Dimer unter Einwirkung von LIcht wieder auf. Bindet jedoch nur im Dunklen an diesen.
• Basenanaloge und Agenzien, die Nukleotidabstand verändern (=interkalierend)
  • Ethidium-Bromid: fixiert sich zw. Basen und macht dadurch nukleinsäurehaltige Bereiche unter UV gut sichtbar
  • 5-bromouracil: wird als Thymin missinterpretiert
• Methyltransferase: entfernt Methylgruppe aus methyliertem Guanin

MMR erkennt falsche Watson-Crick Basenpaarung

BER erkennt fehlerhafte Sequenzen, ohne dass diese gewölbt sind

NER erkennt Wölbung in DNA, häufig durch UV (Thymidindimer)

Defekte Base: base excision

• Defekte Base (= oxidiertes Guanin) kann aus DNA rausgeklappt und entfernt werden
• OxoG:A garantiert fehlerfreie Korrektur dank Glycosilase, zwei Interventionsstellen
  • vor Replikation: Base excision durch DNA-Glycosylase
  • nach Replikation: fail-safe Glycosylase erkennt oxoG und interpretiert es als normales G --> einbau eines korrekten C statt A und zurück zu "vor Replikation"

Defektes Nucleotid: nucleotide excision

• lokale DNA-Denaturierung mit folgenden Ausbau und Neusynthese durch DNAPolymerase
• UvrA/B/C/D
  • A&B: bilden tetramer, wovon nur B an Fehlersequenz verbleibt
  • ein B wird durch UvrC ersetzt --> Schnitt um Läsion
  • UvrD entfernt Fehlersequenz sowie UvrC
  • Loch wird gefüllt
• Uracil-Glykosylase: entfernt zuerst Uracil, danach mithilfe AP-Exonuclease das basenloose Nukleotid. Pol I füllt Loch wieder mit T statt U aus (Uracilglykosilase korrigiert fehlerhafte DNA, die noch mit rNTP aufgebaut ist)

Dienen Reparatur von Doppelstrangbrüchen, Mutationsrisiko dabei relativ hoch

Homologe Rekombination

• dient Schutz vor Doppelstrangbrüchen und Mutationen
• kann nur erfolgen, wenn zwei dsDNA vorhanden sind, die zudem sehr ähnlich (homolog) sind
• ähnelt CO, nur wird keine Erbinformation ausgetauscht sondern kopiert (template strang bleibt unverändert)
• Mechanismus
  • Holliday-Struktur

Nicht homologe Rekombination

• NHEJ: nicht homologes end-joining von dsDNA. "Nicht homolog" weil keine template verwendet wird, sondern einfach wieder zusammengeklebt
  • Mutationen vorprogrammiert, weil Verdau 1-2 Nukleotiden nötig, um Zusammenfügen zu ermöglichen
    • Artemis: Exonuclease funktion
    • Ku70&80 binden an Bruchenden
    • spezielle Ligase und Hilfsproteine
  • wird für Antikörper Designing verwendet, verantwortlich für grosse Vielfalt an Möglichen Antikörpern

Translesions-Synthese

• Doppelstrangbrüche können zwar repariert werden, dennoch vermeidet sie die Zelle stark: Der Translesionsmechanismus dient dem nicht-Abbrechen der DNA-Replikation, wenn dabei ein Fehler auftaucht. Der Fehler wird absichtlich toleriert, um Zelltod zu verhindern, in der Hoffnung, ihn später korrigieren zu können.
• Spezielle DNA-Polymerasen, Translesionspolymerasen, können spez. Fehler erkennen und werden diese mit bestimter Sequenz codieren, um später Korrektur vornehmen zu können.
  • gap-filling-modell
  • polymerase-swichting-modell

Holliday-junction:

Eigenschaften

• zwischen zwei Homologen möglich (Ausnahme Doppelstrangbruch?)
• χ-Site: Hotspot für hom Rekomb weil es RecBCD-Aktivität reguliert
• Mobil: Hollydayjunctions können wandern

Entstehung

• Stranginvasion
  • Einführen eines Doppelstrangbruches
    • Pro: benötigen hierfür keine Enzyme!
    • Euk: Spo11 (ähnlich Topoisomerase)
      • arbeitet mit MRX
  • Overhang-Bildung
    • Pro: RecBCD
      1. Helicaseaktivität: RecD schnell in 5' und RecB langsam in 3'-Richtung --> Schlaufenbildung, ATP-Verbrauch
      2. RecC erkennt Chi wenn Schlaufe verkürzt wird
         • --> Bau RecA initiiert (dieses steht mit SSB in Konkurrenz)
         • --> RecBCD-Komplex bleibt stehen
    • Euk: MRX-komplex arbeitet 5'3' und generiert dank seiner Exonuclease-Aktivität 3' overhangs
  • Pairing
    • Euk: Rad51 und Dcm (das nur in Meiose in Zelle vorkommt)
    • Pro: RecA
      • bindet an 3' overhangs (aus 5' kommend, arbeiten in 5'3')
        • streckt DNA durch Entspiralisierung --> vereinfacht Suche nach Homologen
        • RecA-Spirale besitzt im Inneren 3 Bestandteile, die effizient nach Homologien suchen können
        • besteht aus Filamenten (ähnlich SSB), wird kooperativ 5'3'  auf ssDNA aufgebaut
          • ssDNA+RecA verbleiben während Stranginvasion zusammen. Der unverdaute STrang paar mit dem RecA-beladenen Strang und bildet dadurch den Heteroduplex.
            • Heteroduplexe: pairing unvollständig, weil Homologe sich in einigen Nukleotiden unterscheiden können --> einige Basen paaren nicht

Auflösung

• nach Replikation
• Genaustausch unterschiedlich möglich, je nach Schnitt
  • Crossover products: alle Stränge verändert
  • Non-crossover-products: ein Strang bliebt unverändert, trotzem Sequenzen ausgetauscht
• Enzyme
  • Pro: RuvAB & RuvC
    • RuvAB-Komplex: erkennt junction und kann diese verschieben
      • RuvB: Helicasefunktion (ATP-Verbrauch): pumpt DNA durch sich selber (Donutförmig) während RuvA die junction innerhalb stabililsiert
    • RuvC: Schneidet H-junction
      • erkennt spez. Sequenz, sobald diese durch Migration der H-Junction in RuvAB-komplex gerät

Aufbau

• target site duplication
• inverted repeats
• transposase
• transposable element

DNA-Transposon (Klasse-II-Transposon): verwenden Transposasen

• konservatives Transposon: vermehrt sich nicht
  • Cut&Paste-Mechanismus
  • inverted repeats
    • ermöglichen self-pairing, da Transposase sticky-ends hinterlässt
  • target-site duplication
• replikatives Transposon: kopiert sich, Kopie besetzt neue Lage in DNA
  •  

RNA-Transposon (Klasse-I-Transposons): verwenden reverse Transkriptase

• Retroviral: mit long terminal repeats
• Nichtretroviral: Ohne LTR

Pseudogene: Abkömmlinge aktiver Gene, die durch Genduplikation, RT oder anderen Ursachen inaktiv wurden, sich aber weiterhin um Genom befinden.

Prozessierte Pseudogene (retro-pseudogen)

• Entstehung: durch Einfügen revers transkribierter mRNA
• "prozessiert" weil Transkription abgelaufen: Spleissen hat stattgefunden, danach zurück in Genom über RT eingebaut
  • Introne fehlen auf mRNA und desawegen auch auf prozessiertem Pseudogen
  • weisen poly-A auf --> mRNA hat keine interne Poly-A --> Indiz für Entstehung aus rev- transkribierter mRNA
  • nicht aktiv weil promotor fehlt
  • werden von inverted-repeats-ähnlichen Sequenzen flankiert

Dupliziertes Pseudogen

• bei Genduplikation durch inaktiviernde Mutation entstandenes Gen
• Beispiel: TOP1

Rekombinasen führen CSSR (conservative site-specific recombination) und Transposition aus: verlagern transposable elements der DNA, die sie über die recombination seites an deren Enden erkennen. Existieren mehrere Möglichkeiten, dabei bleibt das transposable element unverändert (deswegen "konservativ", trpsle-element wird nur an Enden geschnitten, um von DNA getrennt zu werden)

• auf derselben site des Chromosoms, nur Reihenfolge der transposable elements wird verändert
  • Insertion, deletion, inversion
  • ≠Transposition weil bei dieser transp.element chromosom wechselt
  • Konservativ
• Transposition (=translocation?) = integrative recombination, bei der transp.el. in nicht-spezifische DNA auf einem anderen DNA-Molekül insertiert wird
• Unterschied zu CO:
  • CO wird über homologe DNA-Sequenzen reguliert, SSR hingegen über Lage von Bindesequenzen für Rekombinasen
  • SSR verändert genepxression, wobei das bei CO nicht der Fall ist

Sinn & Nutzen

• Genmanipulierung und Bioengeneering
• Antigen-Expression --> Beispiel für die Variierung der genepxression durch SSR

vgl Mind-Map weisses Mäppchen

Mechanismus: Backbone wird gebrochen, Rekombinase bindet kovalent an DNA und bildet dadurch ein Protein-DNA-Kovalent. Nach Transport läuft Reaktion (Nu-Angriffe) rückwärts ab und DNA wird dadurch wieder verschweist (keine Ligase nötig). Serin- sowie Tyrosin-Kinasen verwenden diesen Mechanismus.

• Serin-Rekombinasen: 1 Serin-Rekombinase schneidet 1 DNA-molekül --> immer 4 davon nötig. Schnitt ist "sticky-end" mässig mit 2 BP overhang und erfolgt an sich überlagernden DNA-molekülen. Erfolgt alles auf einmal
  • Hin-Ser-Rekombinase: durch Inversion (Hin erkennt hix-recomb. sites) wird entweder H1 oder H2-flagellin Gen exprimiert --> schützt/versteckt Salmonellen vor fremden Immunsystemen
    • zusätzlich auch FIS (de pute) --> statt zweiförmiges wird dreiförmiges Segment gebildet, Rekombinationsrate wird 1000x grösser
• Tyrosin-Rekombinasen: Schneiden und verbinden zuerst zwei von vier DNA-Molekülen, danach restlichen zwei --> Vorsicht mit 5' & 3'- Enden: werden immer nur 5' + 3' bzw 3' + 5' verbunden. D.h. zuerst werden die beiden 5'3'-Moleküle verlinkt, danach die beiden 3'5'-Moleküle
  • λ-Bakteriophage: ds-DNA befällt Wirt-DNA und baut sich dank AttP & AttB ein. Zwei Zustände möglich
    • lytisches Wachstum: Synthese neuer Viren, Absterben Wirts
      • Lambda-Rekombinase inaktiv
    • Lysogene Vermehrung: Vermerhrung des Wirtes mit infizierter DNA
      • induziert durch Aktivität der lambda-Rekombinase + IHF: integration host-factor: verbindet Phagen und Wirt-DNA so, dass lambda-Rekombinase an beide binden kann
  • Phage P1-Cre: infiziert seinen Wirt mit einem Plasmid, das nicht in Wirt-DNA eingebaut wird. Für Vererbung dieses Plasmides ist es jedoch wichtig, das sich neue, vom Wirt synth. Plasmide von der Wirt-DNA trennen (bilden Dimer zwei ineinander verschlossener Ringe) --> Cre/lox-System
    • Cre: rekombinase (SSR, Tyr-Kinase!), die Plasmide trennt und wieder versiegelt
    • lox: recognition sites auf Wirt und Phagen-Plasmid

Grundgerüst

• aus rRNA aufgebaut, mit proteinen (UE) ergänzt
  • mRNA und tRNA bindene Stellen sind von Proteinen fast komplett frei
  • rRNA:
    • wird durch Spleissen im Nucleolus "gereift"
    • bestimmt Struktur der Ribosomen, da Proteine später an dieser anhaften
  • Proteine: rpS & rpL
    • stark basisch weil viel Lys & Arg --> dringen ins Innere des Ribosoms ein und sind mit der anionischen rRNA fest/stabil verbunden
    • bilden globuläre Domänen auf Ribosomenoberfläche
• Untereinheiten 70s Ribosom (Prokaryoten)
  • 30s
    • 21 Proteine & eine 16S rRNA
      • 16S RNA erkennt Shine-Dalgarno-Sequenz auf mRNA (dank der eigenen anti-Shine-Dalgarno-Sequenz) und kann damit mRNA binden.
    • einzelnen Bestandteile der 30S UE sind mobil --> wichtig für Transkription
    • Anticodon-Arm --> bindet mRNA
  • 50s
    • 31 proteine & 23S sowie 5S rRNA
    • Akzeptor Arm: nimmt tRNA auf (sicher?)
    • Polypeptidtunnel: Durchtrittstelle des synth. Proteins. Am Ausgang werden Prozessierung,Faltung und Lokalisation des naszierenden Proteins durch Faktoren beeinflusst/gegeben.
      • L4e und L22 bilden Engstelle und sind konservierte rib.Proteine
  • A,E und P-Stelle
    • werden durch Halbseiten der beiden Untereinheiten gebildet
      • A,P und E-Stelle befinden sich zwischen den UE
      • A,P und E-Stelle beschreiben nur Lokalisierung: Jede Stelle wird beim Wandern des Ribosomes einmal zur A, danach P, danach E und wieder zu A Stelle
        • Polpeptid ist immer auf P-Stelle
    • A: ankommende Aminoacyl-tRNA (=tRNA mit AS) wird aufgenommen
    • P: Proteinbildung durch übertragung der AS auf die naszierende Polypeptidkette, die zT im Tunnel steckt aber immer auf P-Stelle verbleibt

• Funktion: vgl. Bild
• Basics
  • bis zu 30% Zellmasse sind Ribosomen
  • Synthese sehr teuer, und dennoch werden/müssen viele Ribosomen synthetisiert werden:
    • rRNA und rp-RNA (ribosomale protein DNA) in ZK, machen 80% gesamten Transkription aus
    • Im Nucleolus: DNA-->pre-rRNA --> 30S rRNA + 50S rRNA
      • diese beiden rRNA gelangen aus Nucleolus in Nucleus und werden mit importierten rpL und rpS ergänzt, bevor sie ins Zytosol entlassen werden.

Initiation

• UE binden an cap und arbeiten in 5'3'-Richtung
  • erste AS eines Polypeptids ist speziell: Formalmethionin (fMet), danach werden am C-Terminus die folgenden AS angehängt
    • fMet durch fMet-tRNA überbracht, die an AUG bindet
  • Initiationsfaktoren notwendig: IF1/2/3
    • IF1: entfernt alle tRNAs, die nicht fMet-tNRA sind
    • IF2: erkennt genau fMEt-tRNA
    • IF3: löst UE voneinander, indem er an 30S bindet. Sobald sich IF3 löst, binden 30S&50S

Elongation

• Dekodierung: Aminoacyl-tRNA bindet an Codon und befindet sich im Ribosom an A Stelle
  • Bindung unter GTP-Hydrolyse
  • EF-Tu verantwortlich für Binden von AS an tRNA und Aminoacytl-tRNA an Ribosom
• Transpeptidierung: Entstehung neuer Peptidbindung durch Übertragung des Peptides von P auf A Stelle bzw von Peptidyl-tRNA auf AMinoacyl-tRNA (die dadurch zur neuen Peptidyl-tRNA wird)
  • Peptidyl-Transferase-Zentrum, das Reaktion katalysiert, besteht aus rRNA --> Ribosom ist ein Ribozym
    Werden werder ATP noch Cofaktoren benötigt, Katalyse erfolgt durch korrekte Positionierung der tRNA/AS/Ribosom/mRNA
• Translokation: Ribosom verlagert sich weiter auf der mRNA, wodruch Stellen wechseln (P zu E, A zu P usw.)
• Elongationsfaktoren (EF) für diese Phase nötig: GTPasen
  • EF sind verantwortlich für Proofreading

Termination

• Während Elongation kann Esterbindeung zweischen tRNA und Peptid aufgrund von vollkommener Abwesenheit von Wasser nicht hydrolysiert werden
  • sobald UAG (oder sonst Stopp-Codon) erreicht wurde, bindet keine passende tRNA.
  • RF (RF1 / RF2)bringt genau ein H2O-Molekül ins Innere des Ribosomes und spaltet dadurch Peptid von tRNA dank Hydrolyse
    • RF3 löst RF1/2 wieder von Ribosom ab

vgl. Bild

Teil III

Abhängig von Stabilität und Export

• Stabilität
  • A) mRNA befindet sich in steady state, dieser wird bestimmt durch
    • Transkriptionsrate der RNA (nicht mRNA, sondern RNA, also unreife RNA mit Intronen)
    • Degradation der mRNA: abhängig von Halbwertszeiten (Beispiel: cycline haben kurze, Myosin haben lange Hwzeiten)
      • Decapping
        • Exonucleasen: Abbau von Seiten her
          • 5'3' wenn Guanylkappe weg, 3'5' wenn Poly-A weg
      • Endonucleasen (ohne decapping): Abbau von innen
  • B) Selektiver Abbau von mRNA:
    • ARE-Domänen: Abschnitte mit viel A&U sind automatisch instabil
    • mRNA-Abschnitte mit viel G und C hingegen sind stabil
  • C) Tubulin mRNA
    • Sind α und β Tubuline (globulläre Proteine) in Cytosol enthalten, wird weitere Synthese von Tubulin-polypeptiden unterbunden, indem Ribosom zum Stillstand kommt und RNA der abbaeunden RNase aussetzt
      • Chemotherapie: Vinblastin (ein Mitosehemmer)
        Microtubuli werden abbgebaut und unlöslich gemacht --> fördert die Synthese neuer Tubuline, wodurch mRNA translation abgebremst wird. Die (Krebs)zellen teilen sich weniger.
  • D) Abbau von mRNA im Zellkern sowie Zytoplasma möglich
• Export
  • SR-Proteine: pendeln zwischen Cytoplasma und Zellkern und binden über ARF (an Exon-junctions) an mRNA. Kontrollieren dadurch den Export von mRNA (und Histon mRNA).
  • Protein Aly: hat nebst Export auch Einfluss auf Spleissen
    • bindet an Exon-Exon junctions --> keine introne, kein Aly, kein Export!
    • bindet stark an gespleisste mRNA und fördert deren Export

Staufen-mediated decay (SMD)

1. Staufen-Protein erkennt und bindet an Staufen-binding-sites auf mRNA
2. UPF1 bildet zusammen mit Staufen-Prot und SBS einen Komplex
3. wird UPF1 nun phosphoryliert, fungiert es als Helicase (helicasen öffnen Stränge)
4. Dadruch werden weitere Translationen nicht möglich und die mRNA abgebaut 

RNA wird im zellkern gespleisst. Dabei verbleiben gewisse proteine an den Exon-Exon-Grenzen. Diese heissen Exonjuntioncomplexes (EJC). EJC werden von Ribosomen während der translation erkannt und entfernt.
Die Vorgänge dienen der Qualitätskontrolle der mRNA, indem fehlerhafte mRNA erkannt und zerstört wird. Sie finden im Cytosol statt.

• nonsense mediated decay
  • frühzeitiges Stoppcodon lässt Ribosom den EJC nicht entfernen. Am Ribisom entstandene UPF-Prot initiieren deanylierendes und decapping-Enzym, die RNA wird "nackt" und dann durch exonucleasen abgebaut
• nonstop mediated decay
  • das Ribosom gelangt auf den poly-A schwanz und beginnt, viel Lysin an Proteinkette zu binden. Situation wird erkannt: protein sowie RNA werden abgebaut
• no-go-mediated decay
  • Ribo blockiert weil Sekundärstruktur der RNA fehlerhaft, oder tRNA nicht auffindbar
    --> RNA wird abgebaut, das Polypeptid bleibt jedoch erhalten 

RNA wird über mRNA zu Protein tranlatiert. Daneben exisiteren RNPs und nicht-codierende RNA

nicht-codierende RNA

• snRNP: small nuclear RNA
  • Zellkern
  • für Erkennung und Spleissen der Introne verantwortlich. Sind somit Teil des Spleissosomes
• snoRNA
  • Führen andere Proteine an richtige stellen
  • Wichtig für Spleissen
  • im ZK
• hnRNA: heterogenenous nuclear RNA
  • rohe RNA ohne Kappen/Tail und mit Exons und Introns --> = primäres Transkript
• miRNA: micro RNA
  • Reguliert Genexpression über posttranskriptionelle Mechanismen (können z.B. Gen-Silencing bewirken)
    • RNA-Interferenz: miRNA passt entweder teilweise (silencing) oder perfekt (Abbau) auf eine RNA

RNP: Ribonucleoproteincomplex

• RNA + Prot bilden komplex, zB Tyr- und Ser-Kinasen
• hnRNP: heterogeneous nuclear ribonucleinparticle (hnRNP bildet Komplex mit pre-mRNA)
• Binden an pre-mRNA und halten diese solange im Zellkern fest, bis sie gereift ist

für Reifung müssen Spleissen sowie Anbringen der Extremitäten stattfinden.

pre-mRNA

• enthält keinen Promotor, dafür Introne und UTR
• entsteht direkt durch Transkription der DNA

mRNA

• UTR: wird nicht translatiert (für Proteinsequenz unwichtig), hat dafür Bindestellen für regulatorische Proteine
  • 5' UTR an Kappe
    • AUG (Start) trennt UTR 5' von codierendem Abschnitt
  • 3' UTR an Poly-A
    • UAG (Stopp) trennt codierenden Abschnitt von Poly-A
  • Codierender Abschnitt
    • Entwicklung von Krankheiten wenn Signalnukleotide gestört werden, weil Leseraster dann falsch
    • Enthält normalerweise keine Bindestellen für regulatorische Proteine

Extremitäten

• Kappe am 5'-Ende
  • modifiziertes Guanin-Nukleotid über spezielle Triphosphat-5'-5' Bdg am Ende der RNA
  • durch methyltransferasen während Transkription aufgesetzt
  • Schutzfunktion vor Exonukleasen, erhöhte Stabilität, ermöglicht Export und erhöht TRanskriptionsrate
• Poly-A
  • Polyadenylierung: Anbringen von 100-250 Adenosin-Nukleotiden an 3' Ende
    • 1) in 3' UTR
      Schnitt zwischen AAUAAA und Poly-U
      2) Polyadenylierung: Ergänzen von Poly-A an Schnittstelle
      PAP erkennt Schnittstelle--> Oligoaddition (langsam): Anbringen der ersten AAA
      PAB2 initiiert infolge Poly-A-Extension (schnell)

Trans-Spleissen

• Verbinden von Exonen aus unterschiedlichen RNAs (können von selben Gen stammen)
• Mechanismus:
  • Leader überträgt sein pGpUp (=Intron?) auf ApGp (=Intron?) der pre-mRNA
    5'2'-Bdg verbinden die übertragene Gruppe mit pre-mRNA
  • die nun Verbundenen Gruppen (sind Introne) werden abgespalten und durch Leader ersetzt

Cis-Spleissen

• Verbinden von Exonen auf gleichen mRNA
• Mechanismus
  • Intron macht NU-Angriff auf sich selber und bildet dadurch Lasso, das ausgeschnitten wird, wodruch sich benachbarte Exone verbinden können
  • Wichtig:
    • Cis-Spleissen benötigt Proteine: U₁, U₂, U₄, U₅, U₆ (=snRNA)
      • diese werden in einem Zyklus in Zellkern ständig rezykliert
      • Lasso-Verschluss (Verknüpfen des freien Endes) sowie Verbinden Exonen ist ATP-abhängig 
    • RNA kann jedoch auch katalytisch aktiv sein und ohne Proteine cis-spleissen

Cis und Transspleissen können gleichzeitig auf gleichem pre-mRNA-Moelkül erfolgen. Sie dienen dem Entfernen der Introne. Danach muss mittels Polyadenylierung das 3' fixiert werden. Es entstehen mehrere mRNA-Fragmente, die nicht miteinander verbunden sind.

• müssen klein und präzis sein
• Lokalisation
  • zwischen intron-Exon
  • im Intron
    • U2: erkennt Verzweigungstellen
  • im Exon
    • ESE: Bindestelle für SR-Proteine

Krankheiten bedingt durch alternatives Spleissen: Spliceopathien

Wenn Bereiche, die für Spleissen wichtig sind (zB UTR) mutieren, läuft alt. Spleissen falsch ab und es entstehen funktionslose oder pathogene Proteine.

Beispiel: Myotone Dystrophie Typ I
3'UTR betroffen, wobei der Fehler auf RNA zurückzuführen ist (Dadurch wird Prot in folge abnormal, aber Quelle des Problems liegt im Spleissen der RNA)

mRNA Export aus Zellkern

• ist regulierbar, hat dadurch Einfluss auf RNA-Aktivität
• srProteine
  • Transportieren Histon-RNA (ungespleisst) sowie normale mRNA
• Aly-Protein
  • Erfüllt Doppelfunktion: für Spleissen und Export wichtig. Fördert Export
  • nicht an pre-mRNA gebunden, bindet erst nach Spleissen an Introne und bildet RNP (Komplex)  

Restriktionsenzyme sind Enzyme, die Bakterium vor fremder DNA schützt:

• Eigene DNA spezifisch Methyliert
• DNA mit ungewöhnlicher Methylierung wird von Restriktionsezymen geschnitten
  --> Kann genutzt werden um DNA an gewünschter Stelle zu schneiden

verschiedene Typen, davon für Klonieren nur jene brauchbar, die kleine Fragmente schneiden

• TypI
  • schneiden zufällig und benötigen ATP
  • Beispiel: SmaI erkennt CCCGGG/GGGCCC schneidet blunt ends an C/G Grenze
• Typ II
  • II: erkennen Palindrome und schneiden 4-8 bp lange Sequenz
  • IIS: erkennen und schneiden asymmetrische Sequenzen, ca. 20bp
  • benötigen kein ATP

Klonen mit Restriktionsenzymen

• Entstehen Enden
  • entweder blunt ends oder sticky ends: sticky mit 3' oder 5' overhang
  • 3' Hydroxyl- (OH) und 5' Phosphatgruppe
  • werden verschiedene Enden (sticky oder blunt) ligiert, entstehen neue Sequenzen, die nicht mehr vom ursprünglichen REnzym erkannt werden.
• Zu Beachten: DNA Adenin Methylse
  • Adenin in GATC wird in unter Einfluss von Dam methyliert, Cytosin in CCAGG oder CCTGG
  • Einige REnzyme werden duch diese Methylierung wirkungslos, andere wirken nur wenn dies der Fall ist

1. DNA aus Organismus isolieren (zB Insulinsequenz aus Mensch)
2. Mit Restriktionsenzym schneiden
3. Klonierungsvektor schneiden und DNA-Fragment ligieren
   • Plasmid: extrachromosomale cDNA
   • Aufbau
     • Origin of Replication: Startpunkt der Replikation
     • selektierbarer Marker: Antibiotikaresistenz
     • multiple cloning site (=Polylinker): dient Enbau von neuen DNA-Fragmenten, da der POlylinker selber mehrere Seqeunzen enthält, die von REnzymen erkannt werden.
4. künstliches Plasmid in Bakterium einschleusen
   • Bakterium
     • Ohne eigenes Restriktionsenzyme
     • Ohne Rekombination
     • Möglichst keine Exonucleasen
     • Auswahl durch Selektionsdruck: Antibiotikaresistenz mit DNA-Fragment eingeschleust

Isolation mRNA

• reife mRNA hat Poly-A-Schwanz, der dank Komplementarität an Poly-T bindet --> Binden, Auswaschen

Rückschreiben mRNA in cDNA

• entsteht Expressionsbibliothek: Introne und Promotersequenzen fehlen
• Vorgehen vgl Bild

• Sequenzbestimmung
  • Resktriktionsenzyme generieren Fragmente
  • Aus Fragmentgrössen Lage der Gene ersichtlich
  • Southern blot: dient Überprüfung
    1. DNA + REnzyme, danach Spalten der DNA --> einzelsträngige Fragmente
    2. Gelektrophorese
    3. Übertragen auf Membran (Nylon, Cellulose) durch Sogwirkung
    4. Sonde: RNA mit komplementärer Sequenz zur gesuchten Sequenz wird auf Membran aufgetragen
       --> Verbinden sich, werden beim Auswaschen erhalten und dadurch extrahiert. Wenn Extraktion erfolgreich, enthielt ursprüngliche DNA die Sequenz.
• Identifizierung von Mutanten
  • Fehlende/Veränderte Seqeunz wird von Restriktionsenzymen anders oder ganr nicht geschnitten
  • andere Muster nach Gelelektrophorese
• Produktion von Rekombinanten Proteinen
  • Insulin, EPO etc.
  • GST-Fusion
• Funktionelle Analyse von Genen und assoziierten Proteinen

Durch GST-Fusion Prozess

Designen

• pGEX: Plasmid, das für GST codiert. GST muss zusammen mit Protein of interest verbunden sein, damit dieses extrahiert werden kann
• Einfügen der gewünschten Sequenz darf Leseraster von pGEX nicht verschieben: MCS muss adaptiert werden
• Primer: werden designt, dann gekauft
  • Forward Primer: synthetisiert 5'3'-Richtung, ist komplementär zu unterem Strang (heisst, man kann einfach die Sequenz ablesen und bestellen. Es sei denn man will Schnittstellen für REnzyme)
  • Reverse Primer: synthetisiert in 3'5'-Richtung, ist komplementär zum oberen Strang
  • REnzyme: Primersequenzen können am komplementären Strang abgelesen werden. Wenn jedoch Schnittstellen eingebaut werden sollen, muss
    • mit sticky ends operiert werden
    • Die Sequenz am sticky end so verändern, dass von REnzyme erkannt wird

Vorgehen

• Sobald codierender Abschnitt mit F und R Primer ergänzt und wieder ligiert wurde, kann rekombinierte DNA erzeugt und mit REnzyme geschnitten (war schliesslich Ziel des Primerdesigning) und als Fragment in pGEX eingefügt werden.

Extrahieren

• rekombinante Proteine bindet über GST an Gluthation. DIeses Glutathion hafter wiederum an Oberfläche von Kügelchen

1. Prot und Küglenchen werden binden: Eluieren restlicher Proteine möglich
2. Zugabe von Gluthation: löst die GST-Bdg, Eluieren des Prot-of-interest möglich