Biotechnologie Gentechnologie BLAl104

Gentransfer über die Befruchtung

Übertragung der Gene ausserhalb der Befruchtung

Es werden nur Gene eigeführt, von denen natürlicherweise ein Genaustausch zum Zielorganismus möglich ist

Die Gene gelangen aus der Arteigenen Pflanzen. Aber ein Genkonstrukt wird eingeführt, dass es in der Ursprungspflanze nicht gibt. Der Promotor, das Gen (proteincodierender Teil) und der Terminator können aus drei unterschiedlichen Genen stammen.

Einführung von Genen aus Arten, mit denen normalerweise kein Genaustausch erfolgt (kombination entsteht in der Natur nicht).

1. Zunächst muss ein Plasmid, das das Wunschgen trägt, isoliert werden. Man kann die gesamte Plasmid-DNA für die Transformation einsetzen oder schneidet nur das Wunschgen (mit Promotor und Terminator) aus.

2. Etwa 1 µm große Gold-, Platin- oder Wolframpartikel werden mit der einzubringenden DNA beschichtet.

3. Die Partikel (Mikroprojektile) werden auf ein so genanntes Makroprojektil aufgebracht.

4. Die Beschleunigung erfolgt z.B. mittels einer durch Explosion ausgelösten Druckwelle. Das Makroprojektil, das die DNA-beschichteten Partikel trägt, wird beschleunigt und trifft letztlich auf eine Sperrplatte.

5. Die Mikroprojektile „fliegen“ weiter und passieren ein Stahlsieb, das einer größeren Streuung dient, und treffen auf die Zielzellen.

6. Durch die hohen Geschwindigkeiten gelangen die Partikel in die Zielzellen. Die DNA löst sich von den Gold-, Platin- oder Wolframpartikel.

7. Die Fremd-DNA wird in das Genom der Zielzelle eingebaut.

8. Aus einer transformierten Pflanzenzelle kann sich eine transgene Pflanze entwickeln.

Das Agrobakterium tumefaciens schleust t-DNA in Pflanzen ein. Die t-DNA ist eine Einzelstrang und wird durch einen Plasmiden im Agrobakterium gebildet. Durch eine positive Chemotaxis wird der Einzelstrang zur Pflanzen-DNA geleitet. Dort wird die t-DNA in die Pflanzen-DNA integriert. Promotoren sorgen dafür, dass die t-DNA aktiv ist. Das Agrobakterium tumefaciens bildet Tumore, die Opine produzieren, die das Bakterium zur Ernährung nutzt.

Für den Gentransfer mit dem Agrobakterium tumefaciens, wird die tumorbildende Sequenz mit der gewünschten Sequenz ausgetauscht. Die Integration des Genes erfolgt an einer zufälligen Stelle der DNA.

Die gezielte Gentransfer, wird ein Gen in einem spezifischen Genabschnitt eingefügt. Es handelt sich um eine neue Methode.

Eine Pflanze die durch gezielte Mutagenese verändert wurde ist keine GVO (biogene Pflanze). Es wurden lediglich gezielt Basenpaare im Gen ausgetauscht. Somit findet kein Gen-transfer statt

"Gen silencing" ist ein Schutzmechanismus vor Viren, die versuchen RNA in eine Zelle zu schleusen. Gelangt eine doppelstarng RNA (dsRNA) in ein Organismus wird diese von Restriktionsenzymen zerschnitten. Die siRNA (zerschnittene dsRNA) wird von RICS-Enzymen erkannt und zu Nukleotiden zersetzt. Durch das Aktivierte RISC-Enzym wird ein weiteres Enzym ausgelösst, dass die zur dsRNA gehörende DNA methyliert. Die methylierte-DNA wird dadurch inaktiviert.

1. Einfügen der Gensequenz in ein Plasmid vom Agrobakterium tumefaciens. Dabei wird der Bereich wo das Gen eingefügt wird durch RP (rigth boarder) und LB (left boarder) begrenzt. Zwischen diesen wird ein Promotor, ein Intron (Codierte Gensequenz), ein Terminator und ein Promotor mit dem Kanamycin sowie einem Terminator eingefügt. Das Intron ist das gewünschte Gen und das Kanamycin ist der Selektionsfaktor. Es braucht einne Selektionsfaktor, weil nicht allen Pflanzen mit dem Agrobakterium tumefaciens die Gensequenz eingefügt wird.
    
2. Die in die Pflanze eingefügte DNA produziert mRNA. Diese mRNA hat eine "sens" und eine "antisens" sowie eine flexible mitte. Durch die fexible Mitte, biegen sich die "sens" und "antisens" seite zueinander und verkleben. Die verklebte mRNA bildet neu eine siRNA. Wird die siRNA von einer Nématode über das Pflanzenmaterial gefressen, so wird die siRNA in der Nématode sofort vom RISC-Enzym als doppelstrang RNA erkannt zersetzt und lösst eine Methylierung bei der eigenen gleichen DNA, die ein Abbild von der siRNA ist aus. Durch diese Methylierung wird die DNA-Sequenz in der Nématode ausgeschaltet und überlebenswichtige Proteine können nicht mehr produziert werden. Dies bedeutet den Tod für die Nématode.