Biotechnologie 3.3

Trennung der "normalen" chromosomalen Bakterien-DNA von der Plasmid-DNA

- Größe

- Konformation

die dreidimensionale Anordnung und Form eines Makromoleküls

- Aufbrechen der Zellen

- Trennung der Bestandteile durch Zentrifugation

Probleme: 

• große Plasmide verbleibe nicht im Überstand

• Verunreinigung des Überstades durch kleine Stücke des Bakterienchromosoms möglich

⇒ Zentrifugation reicht allein nicht aus, um das Bakterienchromosom von Plasmid-DNA zu trennen

genomische Bakterien-DNA liegt ringförmig, die Plasmid-DNA meist überspiralisiert vor.

1. CsCl-Dichtegradienten-Zentrifugation mit Ethidium-Bromid

⇒ überspiralisierte DNA-Form (Plasmid-DNA) kann weiniger EtBr binden als andere DNA-Formen, hat dadurch höhere Dichte (durch EtBr-Einlagerung wird DNA leicht gestreckt)

2. Alkalidenaturierung

⇒ bei pH 12,0-12,5 wird jede DNA (chromosomale Bakterien-DNA, wie auch Plasmid-DNA) denaturieren, aber die überspiralisierte DNA-Form (Plasmid-DNA) nicht so stark (sie kann daher besser renaturieren.

1. Herstellen des CsCl-Gradienten: Zentrifugation bei 50.000 rpm ⇒ niedrige CsCl-Konz. oben, hohe CsCl-Konz. unten

2. Auftragen des zu trennenden Substanzgemisches

3. Zentrifugation bei sehr hoher Umdrehungszahl ⇒ Stoffe wandern "nach unten" bis zur entsprechenden CsCl-Dichte

wird auch alkalische Lyse oder Plasmid-Präparation genannt

1. Vermehrung von Bakterien und damit der Plasmide in einer Flüssigkultur

2. Trennung von Nährlösung und Bakterien durch Zentrifugation → "Bakterienpellet"

3. Entfernung der Nährlösung und Resuspendieren des Pellets in Puffer

4. Aufbrechen der Zellen (Lyse) durch Mischen mit "Seifenlösung" (Puffer enthält SDS) evtl. Zugabe von Lysozym (erleichtert Abbau der Bakterien-Zellwände)

5. Denaturierung der chromosomalen DNA durch Zugabe von NaOH zum Puffer ⇒ pH-Wert steigt auf pH 12

6. schnelle Neutralisiation der Lösung mit Kalium-Acetat ⇒ denaturierte chromosomale DNA fällt zusammen mit Proteinen, Zellresten etc. aus, Plasmid-DNA renaturiert und bleibt in Lsg.

7. Trennung der Zellreste und denaturierter Bakterien-DNA von Plasmid-DNA (in wässriger Lsg.) durch Zentrifugation

8. evtl. Reinigung der Plasmid-DNA durch Phenol-Extraktion

9. Aufkonzentrierung der Lsg. über z.B.: Alkoholfällung ⇒ reine Plasmid-DNA

Viren, die Bakterien befallen, und diese im Verlauf der Infektion lysieren

1. Bakterienkultur wird mit Phagen infiziert und herangezogen ⇒ Phagen zerstören (lysieren) Bakterienzellwände und werden freigesetzt.

2. Abbau der bakteriellen DNA durch DNasen, Trennung der übrig gebliebenen Bakterienbestandteilen von den Phagenpartikel durch Zentrifugation

3. Phagen-DNA muss aus Phagenkopf (Capsid) extrahiert werden: Phenol-Extration ⇒ Denaturierung der Capsid-Proteine, Phagen-DNA wird freigesetzt

4. Fällung der Phagen-DNA aus der wässrigen Phase über z.B. Alkoholfällung