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Plasmid (Definition)

kleine, ringförmige DNA-Moleküle, die zusätzlich zur chromosomalen Bakterien-DNA vorkommen können

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Was ist wichtig bei der Extraktion von Plasmiden?

Trennung der "normalen" chromosomalen Bakterien-DNA von der Plasmid-DNA

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Wie unterschiedet sich das Bakterienchromosom von der Plasmid-DNA?

- Größe

- Konformation

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Konformation (Definition)

die dreidimensionale Anordnung und Form eines Makromoleküls

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Trennung aufgrund der Größe

(Plasmide und chromosomale Bakterien-DNA)

- Aufbrechen der Zellen

- Trennung der Bestandteile durch Zentrifugation

Probleme: 

• große Plasmide verbleibe nicht im Überstand

• Verunreinigung des Überstades durch kleine Stücke des Bakterienchromosoms möglich

⇒ Zentrifugation reicht allein nicht aus, um das Bakterienchromosom von Plasmid-DNA zu trennen

 

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Trennung aufgrund von Konformation

(Plasmide und chromosomale Bakterien-DNA)

genomische Bakterien-DNA liegt ringförmig, die Plasmid-DNA meist überspiralisiert vor.

1. CsCl-Dichtegradienten-Zentrifugation mit Ethidium-Bromid

⇒ überspiralisierte DNA-Form (Plasmid-DNA) kann weiniger EtBr binden als andere DNA-Formen, hat dadurch höhere Dichte (durch EtBr-Einlagerung wird DNA leicht gestreckt)

2. Alkalidenaturierung

⇒ bei pH 12,0-12,5 wird jede DNA (chromosomale Bakterien-DNA, wie auch Plasmid-DNA) denaturieren, aber die überspiralisierte DNA-Form (Plasmid-DNA) nicht so stark (sie kann daher besser renaturieren.

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Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugation

1. Herstellen des CsCl-Gradienten: Zentrifugation bei 50.000 rpm ⇒ niedrige CsCl-Konz. oben, hohe CsCl-Konz. unten

2. Auftragen des zu trennenden Substanzgemisches

3. Zentrifugation bei sehr hoher Umdrehungszahl ⇒ Stoffe wandern "nach unten" bis zur entsprechenden CsCl-Dichte

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Alkalidenaturierung

wird auch alkalische Lyse oder Plasmid-Präparation genannt

 

1. Vermehrung von Bakterien und damit der Plasmide in einer Flüssigkultur

2. Trennung von Nährlösung und Bakterien durch Zentrifugation → "Bakterienpellet"

3. Entfernung der Nährlösung und Resuspendieren des Pellets in Puffer

4. Aufbrechen der Zellen (Lyse) durch Mischen mit "Seifenlösung" (Puffer enthält SDS) evtl. Zugabe von Lysozym (erleichtert Abbau der Bakterien-Zellwände)