Biotechnologie 3.3
DNA-Extraktion (Plasmide und Phagen) Klonierung der DNA-Moleküle
DNA-Extraktion (Plasmide und Phagen) Klonierung der DNA-Moleküle
Fichier Détails
| Cartes-fiches | 11 |
|---|---|
| Langue | Deutsch |
| Catégorie | Biologie |
| Niveau | Apprentissage |
| Crée / Actualisé | 24.12.2013 / 09.10.2017 |
| Lien de web |
https://card2brain.ch/box/biotechnologie_3_3
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| Intégrer |
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Plasmid (Definition)
kleine, ringförmige DNA-Moleküle, die zusätzlich zur chromosomalen Bakterien-DNA vorkommen können
Was ist wichtig bei der Extraktion von Plasmiden?
Trennung der "normalen" chromosomalen Bakterien-DNA von der Plasmid-DNA
Wie unterschiedet sich das Bakterienchromosom von der Plasmid-DNA?
- Größe
- Konformation
Konformation (Definition)
die dreidimensionale Anordnung und Form eines Makromoleküls
Trennung aufgrund der Größe
(Plasmide und chromosomale Bakterien-DNA)
- Aufbrechen der Zellen
- Trennung der Bestandteile durch Zentrifugation
Probleme:
• große Plasmide verbleibe nicht im Überstand
• Verunreinigung des Überstades durch kleine Stücke des Bakterienchromosoms möglich
⇒ Zentrifugation reicht allein nicht aus, um das Bakterienchromosom von Plasmid-DNA zu trennen
Trennung aufgrund von Konformation
(Plasmide und chromosomale Bakterien-DNA)
genomische Bakterien-DNA liegt ringförmig, die Plasmid-DNA meist überspiralisiert vor.
1. CsCl-Dichtegradienten-Zentrifugation mit Ethidium-Bromid
⇒ überspiralisierte DNA-Form (Plasmid-DNA) kann weiniger EtBr binden als andere DNA-Formen, hat dadurch höhere Dichte (durch EtBr-Einlagerung wird DNA leicht gestreckt)
2. Alkalidenaturierung
⇒ bei pH 12,0-12,5 wird jede DNA (chromosomale Bakterien-DNA, wie auch Plasmid-DNA) denaturieren, aber die überspiralisierte DNA-Form (Plasmid-DNA) nicht so stark (sie kann daher besser renaturieren.
Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugation
1. Herstellen des CsCl-Gradienten: Zentrifugation bei 50.000 rpm ⇒ niedrige CsCl-Konz. oben, hohe CsCl-Konz. unten
2. Auftragen des zu trennenden Substanzgemisches
3. Zentrifugation bei sehr hoher Umdrehungszahl ⇒ Stoffe wandern "nach unten" bis zur entsprechenden CsCl-Dichte
Alkalidenaturierung
wird auch alkalische Lyse oder Plasmid-Präparation genannt
1. Vermehrung von Bakterien und damit der Plasmide in einer Flüssigkultur
2. Trennung von Nährlösung und Bakterien durch Zentrifugation → "Bakterienpellet"
3. Entfernung der Nährlösung und Resuspendieren des Pellets in Puffer
4. Aufbrechen der Zellen (Lyse) durch Mischen mit "Seifenlösung" (Puffer enthält SDS) evtl. Zugabe von Lysozym (erleichtert Abbau der Bakterien-Zellwände)
Ablauf der DNA-Isolierung (Fotsetzung)
5. Denaturierung der chromosomalen DNA durch Zugabe von NaOH zum Puffer ⇒ pH-Wert steigt auf pH 12
6. schnelle Neutralisiation der Lösung mit Kalium-Acetat ⇒ denaturierte chromosomale DNA fällt zusammen mit Proteinen, Zellresten etc. aus, Plasmid-DNA renaturiert und bleibt in Lsg.
7. Trennung der Zellreste und denaturierter Bakterien-DNA von Plasmid-DNA (in wässriger Lsg.) durch Zentrifugation
8. evtl. Reinigung der Plasmid-DNA durch Phenol-Extraktion
9. Aufkonzentrierung der Lsg. über z.B.: Alkoholfällung ⇒ reine Plasmid-DNA
Phagen (Definition)
Viren, die Bakterien befallen, und diese im Verlauf der Infektion lysieren
Extraktion von Phagen-DNA
1. Bakterienkultur wird mit Phagen infiziert und herangezogen ⇒ Phagen zerstören (lysieren) Bakterienzellwände und werden freigesetzt.
2. Abbau der bakteriellen DNA durch DNasen, Trennung der übrig gebliebenen Bakterienbestandteilen von den Phagenpartikel durch Zentrifugation
3. Phagen-DNA muss aus Phagenkopf (Capsid) extrahiert werden: Phenol-Extration ⇒ Denaturierung der Capsid-Proteine, Phagen-DNA wird freigesetzt
4. Fällung der Phagen-DNA aus der wässrigen Phase über z.B. Alkoholfällung
