Biotechnologie 3.3
DNA-Extraktion (Plasmide und Phagen) Klonierung der DNA-Moleküle
DNA-Extraktion (Plasmide und Phagen) Klonierung der DNA-Moleküle
Kartei Details
Karten | 11 |
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Sprache | Deutsch |
Kategorie | Biologie |
Stufe | Berufslehre |
Erstellt / Aktualisiert | 24.12.2013 / 09.10.2017 |
Lizenzierung | Kein Urheberrechtsschutz (CC0) |
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Plasmid (Definition)
kleine, ringförmige DNA-Moleküle, die zusätzlich zur chromosomalen Bakterien-DNA vorkommen können
Was ist wichtig bei der Extraktion von Plasmiden?
Trennung der "normalen" chromosomalen Bakterien-DNA von der Plasmid-DNA
Wie unterschiedet sich das Bakterienchromosom von der Plasmid-DNA?
- Größe
- Konformation
Konformation (Definition)
die dreidimensionale Anordnung und Form eines Makromoleküls
Trennung aufgrund der Größe
(Plasmide und chromosomale Bakterien-DNA)
- Aufbrechen der Zellen
- Trennung der Bestandteile durch Zentrifugation
Probleme:
• große Plasmide verbleibe nicht im Überstand
• Verunreinigung des Überstades durch kleine Stücke des Bakterienchromosoms möglich
⇒ Zentrifugation reicht allein nicht aus, um das Bakterienchromosom von Plasmid-DNA zu trennen
Trennung aufgrund von Konformation
(Plasmide und chromosomale Bakterien-DNA)
genomische Bakterien-DNA liegt ringförmig, die Plasmid-DNA meist überspiralisiert vor.
1. CsCl-Dichtegradienten-Zentrifugation mit Ethidium-Bromid
⇒ überspiralisierte DNA-Form (Plasmid-DNA) kann weiniger EtBr binden als andere DNA-Formen, hat dadurch höhere Dichte (durch EtBr-Einlagerung wird DNA leicht gestreckt)
2. Alkalidenaturierung
⇒ bei pH 12,0-12,5 wird jede DNA (chromosomale Bakterien-DNA, wie auch Plasmid-DNA) denaturieren, aber die überspiralisierte DNA-Form (Plasmid-DNA) nicht so stark (sie kann daher besser renaturieren.
Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugation
1. Herstellen des CsCl-Gradienten: Zentrifugation bei 50.000 rpm ⇒ niedrige CsCl-Konz. oben, hohe CsCl-Konz. unten
2. Auftragen des zu trennenden Substanzgemisches
3. Zentrifugation bei sehr hoher Umdrehungszahl ⇒ Stoffe wandern "nach unten" bis zur entsprechenden CsCl-Dichte
Alkalidenaturierung
wird auch alkalische Lyse oder Plasmid-Präparation genannt
1. Vermehrung von Bakterien und damit der Plasmide in einer Flüssigkultur
2. Trennung von Nährlösung und Bakterien durch Zentrifugation → "Bakterienpellet"
3. Entfernung der Nährlösung und Resuspendieren des Pellets in Puffer
4. Aufbrechen der Zellen (Lyse) durch Mischen mit "Seifenlösung" (Puffer enthält SDS) evtl. Zugabe von Lysozym (erleichtert Abbau der Bakterien-Zellwände)