Biotechnologie 3.1

1. Exonukleasen: bauen NS von den Enden her ab

2. Endonukleasen: spalten innerhalb einer NS

3. Desoxyribonukleasen: (DNasen) bauen DNA ab

4. Ribonukleasen: (RNasen) bauen RNA ab

5. Restiktionsendenukleasen: mit spezifischen Schnittstellen

1. Exonuklease III

2. Bal 31

3. DNase I

4. Endonuklease S1

- aus E.coli

- spaltet nur am 3' -Ende eines Doppelstranges Nukleotide ab, sodass zum Teil lange einzelsträngige Abschnitte entstehen

- baut Nukleotide von beiden Enden (3' & 5') eines DNA-Doppelstrangs ab.

- schneidet an unspezifischen Stellen ihnnerhalb der DNA

- schneidet einzel- und doppelsträngige DNA, sodass ein Gemisch zum Teil aus sehr kurzen Fragmenten entsteht.

- Je nach Gegewart der Kationen werden beide Stränge an der gleichen Stelle geschnitten (+ Mn²⁺) oder an versetzten Stellen (+ Mg²⁺)

- Mit hohen DNasen I - Konzentration kann DNA aus RNA-Lsg. entfernt werden

- schneidet nur einzelsträngige DNA- oder RNA-Moleküle

- Einzelsträngige Lücken in der DNA können herausgeschnitten werden

1. Alkalische Phosphotase

2. Polynukleotidkinase

3. Terminale Desoxyribonukleotidyltransferase

entfernt Phosphatgruppen vom 5'Ende der DNA-Moleküle

fügt Phosphatgruppen an 5'Ende der DNA-Moleküle an (umgekehrte Wirkung wie bei Alkalischer Phosphotase)

fügt ein oder mehrere Desoxynukleotide an das 3'Ende von DNA-Molekülen an

(braucht kein Matrizenstrang, Variabilität wird verlängert -> unterschiedliche Proteine z.B.: für Immunsystem)

Nukleasen schneiden DNA-Basensequenzen an bestimmten Stellen

Abbau von fremden NS bei Bakterien

1. Typ II: schneidet direkt an der Erkennungssequenz

2. Typ I: schneidet in bis zu 1000 bp Entfernung

3. Typ III: in 20-25 bp Entfernung von der Erkennungssequenz

(wichtig für genetisches Arbeiten nur Typ II)

- die Sequenz, an der aufgrund der spezifischen Basenabfolge die DNA geschnitten wird.

- bestehen meistens aus 4,6, oder 8 bp (4-, 6-, 8-bp-Cutter)

eine DNA-Sequenz, die in beiden Leserichtungen die gleiche Basenabfolge besitzt

1. glatte Enden: (blunt ends) ohne Übergang des einen Stranges

2. klebrige Enden (stricky ends) durch versetzte Schnitte in den beiden DNA-Strängen

Restriktionsenzyme, mit der gleichen Erkennungssequenzen, die aus verschiedenen Organismen stammen

verknüpfen NS, indem sie Phosphatdiesterbindungen endständigen Nukleotiden ausbilden

Verknüpfen von DNA-Fragmenten (Okazaki-Fragmente)

Um DNA-Fragmente aus unterschiedlichen Organismen zu verknüpfen, die mit demselben (oder isoschizomeren) Restriktionsenzym geschnitten werden.

synthesieren einen neues DNA-/RNA-Strang anhand eines komplementären Matrizenstranges.

1. DNA-Polymerase I

2. Klenow-Fragment

3. Thermostabile Polymerase

4. Riverse Transkriptase

- besitzt 5'→3'-Polymerasen-Aktivität

- besitzt 3'→5'-Exonukleasen-Aktivität

- binden an den Einzelstrangabschnitt in der DNA oder an einem Bruch in der DNA (Nick) und kann einen neues Strang synthesieren (5'→3'-PA)

- gleichzeitig kann der vorhandene Strang abgebaut werden (5'→3'-EA)

- Mit der 3'→5'-EA kann sie flasch eingebaute Nukleotide wieder entfernen (pfoofreading)

- Teilstücke der DNA-Polymerase I ohne 5'→3'-EA (keine Abbau von Nukleotiden in 5'→3-Richtung

- gleich aktiv wie DNA-Polymerase I

- hitzestabile Enzyme (werden bei hohen Temp. nicht zerstört)

- mit unterschiedlichen Exon-Akt. (mit oder ohne proofreading)

- mit verschiedenen Fehlerraten beim Einbau von Nukleasen

kann RNA in DNA umwandeln

- DNA-Pol. I: DNA-Replikation, DNA-Reparatur

- Taq-Polymerase: Reparatur von DNA bei Bakterien, die in heißen Quellen leben

- riverse Transkription: Replikation bei vielen Viren

- DNA-Pol. I: Markierung von DNA

- Klenow-Fragment: Markierung von DNA (Auffülreaktion, aber auch Endmarkierung an klebrigen Enden, DNA-Sequenzierung

- Taq-Polymerase: Polymerasenkettenreaktion (PCR)

- Riverse Transkription: Umschreiben von RNA in DNA