Biotechnologie

EU-Richtlinie: 1829/2003/EG
Freisetzungsrichtlinie: 2001/18/EG
Wichtig: 1830/2003/EG

Erzeugung von und mit gentechnisch veränderten Organismen (GVO) nach Gentechnikgesetz.

Nährmedien enthalten in der Regel 95-97% Wasser. Substrate, Stickstoffquellen, Mineralstoffe und Vitamine sind gelöst oder suspendiert im Nährmedium.
Technische Zusätze: Antischaummittel (Speiseöl), Präkursoren (Intermediate des Zielproduktes, zur Erhöhung der Ausbeute). Nährmedium muss an die Ansprüche der Mikroorganismen angepasst werden : Energiequelle, Stickstoffbedarf, Mineralstoffbedarf

Schrittweise Anpassung an unterschiedliche Nährstoffzusammensetzung und Volumenerhöhung.
Upstream-Processing: Herstellung des Fermentationsmediums (Züchtung von Stammkultur, die ausreichend ist, um im Produktionsfermenter genügend Mikroorganismen zu bilden.  Schrittweise Vergrößerung der Kulturstufen im Verhältnis 1:3 bis 1:10
Schritte: Master Cell Bank (-196°C, in flüssigem Stickstoff gelagert)
2. Working Cell Bank (1000 KbE/ml, gefroren in kleinen Portionen)
3. Impfgutvermehrung von Agrarplatte bis Fermenter
Agrarplatte (Kolonie)-Schrägagar(Stammkultur)-300ml Schüttelkultur-3l Rührkultur-30-3.000l Vorfermenter- bis 500.000l Produktionsfermenter
Langsame Schritte zur Volumenerhöhung, weil Mikroorganismen sich je nach Volumenumfang anders verhalten, da die Sauerstoffzufuhr über verschiedene Prinzipien erfolgt, die Homogenität soll stets erhalten bleiben (optimierte Bedingungen für die Eigenschaften der Mikroorganimen). Bei direkter Gabe der Mikroorganismen in den Produktionsfermenter besteht durch die lange Dauer die Gefahr der Vermehrung schädigender Mikroorganismen.

Emers-Verfahren: ursprünglich
Oberflächenverfahren, Kultivierung auf festen/flüssigen Nährböden, wie z.B. Agarplatte, Belüftung der Oberfläche, Extraktion de Produktes nach Abschluss der Fermentation

Submers-Verfahren
Vorkulturführung, die Kultivierung erfolgt in Fermentern, Sauerstoffversorgung erfolgt durch den im Nährmedium gelösten Sauerstoff.

Stellgröße: Parameter, die man direkt einstellen kann (Prozesssteuerung), Heiz-/KühlstromàTemperatur (Mikroorganismen besitzen ein Temperatur-Optimum:thermophil, mesophil, psychrophil), Dosage des Sauerstoffs (gelöster Sauerstoff) à Aerobier, aerotolerant, fakultativ anaerob.
Zustandsgrößen: beschreiben das Medium und den Prozess und sind indirekt durch Stellgrößen beeinflussbar. pH-Wert: Produktion der Biomasse, Wachstumsrate, organische Verbindungen.
Temperatur: Produktion von Biomasse, Wachstumsrate, organische Verbindungen
Zielgrößen: Ergebnis, ist nicht direkt beeinflussbar: Produktion von Biomasse, Wachstumsrate beeinflusst durch den pH-Wert , Substratkonzentration, gelöstem Sauerstoff, Temperatur und gebildeten organischen Verbindungen.
Ziel: Optimiertes Zellwachstum, dafür muss unter anderem die Temperatur entsprechend eingestellt werden.

Stellgrößen. Alle 3 Faktoren haben einen großen Einfluss auf Wachstum, Entwicklung und Produktionder Mikroorganismen. Müssen je nach den Ansprüchen der entsprechenden Mikroorganismen eingestellt werden.

Ziel: vollständige Abtrennung der Zellmasse, Produkteinheit
1. Zellernte: Abtrennung des Nährmediums (disperses System)durch Zentrifugation oder Filtration.
2. Zellaufschluss: Zerstörung der Zellwände/-membranen um intrazellulär gebildete organische Verbindungen/Stoffwechselprodukte gewinnen zu können. Membranen müssen durchlässig gemacht werden, oder durch Scherkräfte zerrissen werden. Mit: Rührwerkskugelmühlen oder Hochdruckhomogenisation.
3.Produktgewinnung und Konzentrierung:  Abtrennung des Produktes von den Zellwänden- Präzipation (Fällung von Proteinen-isoelektrischer Punkt), Schaumseperation, Membranseperation (Ultrafiltration), Solventextraktion.
4. Produktreinigung: Abtrennung unerwünschter Proteineund Enzyme, um Reinheitsanfporderungen zu erfüllen. Elektrokinetische Trennverfahren, Chromatographische Trennverfahren.
5. Trocknung: Senkung des aw-Werts: Haltbarkeit, Stabilität, Lagerfähigkeit. Handhabung: Gefriertrocknung oder Sprühtrocknung.

Sedimentation:  Wirkung der Schwerkraft. Trennung nach Dichte (disperse Phase und kontinuierliche Phase). Absetzen der Teilchen. Ziel: Entmischung von Suspensionen in klare Flüssigkeit und Sediment.
Filtration: Ziel: Abscheidung von Feststoffteilchen aus Suspensionen in Filtrat und Filterkuchen (Retentat). Wirkende Kräfte: Druckdifferenz, Trennung nach Größe, Prozess: Zurückhalten der Teilchen.
Zentrifugation:  Ziel: Entmischen von Suspensionen in Zentrifugat und Sediment. Wirkende Kräfte: Schwerkraft, Fliehkraft. Trennung nach Dichte. Prozess: Absetzen der Teilchen.

Ausfällen der Proteine aus der Suspension, weil Proteine zu Verbunden aggregieren.  Änderung der Eigenschaften des Solvens.
Salz (Aussalzen): Abnahme der Löslichkeit, Herabsetzen der Interaktionsenergien.  Besonders Ammoniumsulfat geeignet.  Organische Lösungsmittel: aw-Wert-Senkung führt zur Senkung der Proteinlöslichkeit (müssen wasserlöslich sein und keine Konformationsänderung der Proteine): Ethanol, Isopropanol, Aceton.
2. Änderung der Eigenschaften der Proteine: Ausfällen am Isoelektrischen Punkt (Nettoladung des Proteins=0, geringste Löslichkeit). Hitzebehandlung und KyropräzipitationàDenaturierung und Ausfall.
3. Affinitätspräzipitation: Affinitätsliganden (Coenzym+Enzym, Antigen+Antikörper). Komplexierung und Fällung: sehr spezifisch.

Trennung von Stoffgemischen, meist molekular – bzw. kolloiddisperse Fluide mithilfe von speziell auf das Trennproblem abgestimmte Membran: Retentant und Permeat.
Membranfiltration: Porengröße 0,1-10mycrometer durch hydrostatischen Druck (0,5-2bar) zur Abtrennung von Zellen (Zellernte).
Ultrafiltration: Porengröße 1-10nm. Durch hydrostatischen Druck: 2-10bar. Zur Abtrennung von Proteinen /Entsalzung.
Die Porengröße unterscheidet sich je nach Anwendungsverfahren und richtet sich auch danach, was abgetrennt werden soll.

Zweck: Trennung von N-Acetyl-D-Methionin und N-Acetyl-L-Methionin zur Gewinnung von L-Methionin.
Aufbau des Reaktors: Hochfasermodul mit immobilisierten Enzym enthält die : Ultrafiltrationsmembran (aus organischen Polymeren) mit geringer Porengröße:enzymatisch umgesetztes Produkt wird durchgelassen, das Enzym nicht. Das Substrat wird durch den Sterilfilter geleitet, damit keine Mikroorganismen in die Anlage gelangen, die dann das Enzym zerstören könnten. Polarimeter dient der Prozesskontrolle: Hier findet eine Messung der Konzentration an optisch aktiven Substanzen statt. Wärmeaustauscher dient der Regulierung der Temperatur.

Produktion induzierbarer Enzyme :  Nährmedien enthalten einen Induktor, um die Codierung der Strukturgene zu induzieren.  (Stärke-Amylase, Cellulose-Cellulase, Saccharose-Saccharase). Eine langsame und stetige Zufuhr des Induktors ist notwendig.
Problem: Feedback-Hemmung durch das Endprodukt: verschiedene Aminosäuren hemmen die Bildung von Proteasen. Zellen und Enzyme werden auf Trägermaterialien fixiert (Buchenholzspäne bei Essigherstellung =klassischer weg, Kieselgel). Enzyme können Reaktionen ohne Anwesenheit des ursprünglichen Organismus durchführen.
Vorteile trägerfixierter Enzyme: Erhöhung der Hitze-und pH-Stabilität, längere Lebensdauer, Mehrfachverwendung der Enzyme möglich, kontinuierliche Prozessführung im Bioreaktor möglich, Vereinfachung der Produktreinigung, Verbesserung der Produktqualität. Immobilisierte Enzyme und Zellen können partikelgebunden oder membrangebunden sein, das führt zu einer möglichen langen Benutzung der Enzyme, die sonst mit dem Produkt wegfließen würden.
Nachteile: Aktivitätsverlust, geringe Diffusionsgeschwindigkeit, fixierte Zellen brauchen eine Erholungsphase nach der Produktion.

Corynebacterium glutamicum ist Biotin-auxotroph. Biotin muss demnach immer von außen zugeführt werden. Durch limitierende Zugabe von Biotin kommt es zu einer Veränderung der Zusammensetzung der Zellmembran, das bewirkt einen verstärkten aktiven Transport von L-Glutamat aus der Zelle. Die Folge: L-Glutamat gelangt in das Medium und wirkt somit nicht weiter hemmend auf seine eigene Synthese.

Citronensäure entsteht natürlicherweise im Stoffwechsel im Citratzyklus. Synthese = Submersverfahren. Vorfermenter: hoher pH-Wert zur Mycelbildung des Asperigillus niger.
Hauptfermenter: eigentliche Citronensäuresynthese findet hier statt, pH-Absenkung auf <3,5 verhindert den Abbau der Citronensäure, verbessert die Durchlässigkeit der Membranen für Citronensäure (Kein Zellaufschluss mehr nötig) und es findet kein Mycelwachstum mehr statt.

Allgemein: auf mRNA AUG (auf kodierender DNA), aber das eigentliche Erkennungsmerkmal ist 6 Nukleotide weiter vorne = Ribosomenbindungsstelle

mRNA: messenger = instabil

tRNA: stabil

rRNA: stabil

1. Isolierung der DNA durch Zerstörung der Zellen (Bakterienchromosom und Plasmid)
2. Restriktionsverdauung: Schneiden der DNA an bestimmten Stellen mit Restriktionsenzymen (Endonukleasen) --> verschiedene Fragmente unterschiedlicher Größe und Gewinnung des gewünschten Abschnitts.
3. Isolierung des Plasmidmoleküls aus einer weiteren Bakterienzelle und Öffnung des Rings durch Restriktionsenzym
4. Ligation: Einfügen des gewünschten DNA-Stranges (Fremd-DNA) durch das Enzym Ligase führt zum Plasmid mit der gewünschten DNA-Sequenz
5. Transformation in der Wirtszelle (z.B. E. coli)
6. Identifizierung und Selektion mithilfe von Selektionsmarkern

Ein Gen, dessen Genprodukt Zellen eine bestimmte Eigenschaft verleiht, die sie von anderen Zellen unterscheidet.
-so ist eine leichte Selektion möglich
-Indirekte Selektionsmarker: Marker wird beim Einbau zerstört und ein Produkt kann nicht mehr gebildet werden, z.B.: Inaktivierung der Lactose-Spaltung: es findet keine blaue Farbreaktion mehr statt, bleibt weiß

ORF = Open Reading Frame
durchgängiges Leseraster, welches nicht durch ein Stopp-Codon unterbrochen wird

Anwendung zur Integration von fremder DNA
--> Gleiche oder fast gleiche Abschnitte eines Chromosoms tauschen untereinander Teile aus (Crossing Over)
-->Nutzung der zelleigenen Rekombinationsenzyme zum Genaustausch
--> Zweimaliges Crossing Over zwischen Plasmid und Chromsom: 1. Konintegrat 2. Resolution
--> Sequenz befindet sich im Chromosom, Plasmid fällt weg

--> Identische Enzymaktivität
--> Identische AS-Sequenz wie Labextrakt
-->identische physikochemische und immunologische Eigenschaften der Proteine
--> keine posttranslationale Modifikation bei beiden
--> keine relevanten Unterschiede bei Käsereiversuchen
--> keine toxischen Substanzen nachweisbar

--> Inaktivierung von bitterspaltenden Proteasen
--> Verstärkung von probiotischen Eigenschaften
--> freisetzung von bioaktiven Peptiden aus Milchprodukten
--> Erzeugung von Phagenresistenz bei Starterkulturen

1. Betrifft Lebensmittel mit neuer/gezielt veränderter primärer Molekülstruktur (Fettersatzstoffe, Süßungsmittel)
2. LM, dei aus Einzellerproteinen bestehen, diese enthalten oder daraus hergestellt werden --> Proteine und andere Stoffe aus Algen, Bakterien, Hefen und Schimmelpilzen
3. LM, die nach bisher nicht gebräuchlichen Verfahren entwickelt wurden, wodurch sich bedeutende Änderungen in Zusammensetzung und Struktur des Endproduktes ergeben ( Nährwert, Verdaubarkeit, Verstoffwechselung usw.)
--> Pasteurisierung mit hydrostatischem Druck
4. Kriterien: Selbstklonierung
Nukleotidsequenz muss bekannt sein, Keine Antibiotikaresistenz als Selektionsmarker, bei Vektoren enger Wirtsbereich

Eignung für LM
--> gentechnische Veränderungen sollten so gering wie möglich gehalten werden, sodass eine einfache Sicherheitsüberprüfung möglich ist.

Problem: Menschen könnten bei der Nahrungsaufnahme Bakterien mit verändertem Erbmaterial aufnehmen.
--> Möglichkeit der Übertragung der Resistenzgene auf andere Mikroorganismen
--> Krankheitserreger könnten therapieresistent
Positiv: einfache Selektion, Starterkulturen sind widerstandsfähig

ABER: Anwendungsverbot bei Lebensmitteln
Lösung: Food-Grade, andere Selektionsmarker, z.B. Hitzeschockgene

Food-Grade: lebensmittelgeeignet
Selbstklonierung: Veränderung der DNA eines Organismus ohne Einführung fremder DNA (nur verwandte Arten inklusive die DNA ihrer Phagen)

Nachweis DNA-Ebene: Die Zielsequenz muss bekannt sein, kommt sonst nicht im zu untersuchenden Genom vor, DNA-Extraktion aus LM, Nachweisreaktion durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR)- Zugabe von Primer, Amplifizierung gewünschter Region, Auftrennung entstandener Kopien durch Agarose-Gelelektrophorese, Bestätigungsreaktion durch Hybridisierung des korrekten Amplifikationsproduktes mit radioaktiver DNA-Sonde, Sequenzspezifische Bindung der Sonde an DNA
Nachweis auf  RNA-Ebene: Gelelektrophorese, Northern Blot, Hybridisierung mit spezifischen, markierten Sonden
Nachweis auf Protein-Ebene: SDS-Gelelektrophorese (Zusätzliche Bande für gentechnisch verändertes Protein im Vergleich zu konventionellen LM), Immunologischer nachweis über spezifische Antikörper, wenn nachzuweisendes Protein bekannt ist
Nachweis des Phänotyps: sichtbar veränderte Eigenschaften, veränderte Enzymaktivität

(Nachweis bei Pflanzen: Der Selektionsmarker, da Entfernung bisher noch schwer möglich)

Ziel: Vervielfältigung der DNA (in großen Mengen)
Prinzip: 1. Denaturierung (90-98°C)
              2. Anlagerung von Primer (50-60°C)
              3. Elongation (70-80°C)
        --> Synthese neuer DNA, beginnend am Primer
--> Enzymatische Vervielfältigung oder Isolierung der DNA
--> 30-50mal wiederholt (Nachweisbarkeit: Gelelektrophorese)
--> hitzeresistente Bakterien