Biopharmazeutika
Grundlagen Gentechnik, Herstellung Proteinwirkstoffe
Grundlagen Gentechnik, Herstellung Proteinwirkstoffe
Durch welche Polymorphismen wird das Blutungsrisiko bei Therapie mit Vitamin-K-Antagonisten erhöht? Mechanismus!
mehrere relevante Polymorphismen:
1. CYP2C9
2.Vitamin-K-Epoxid-Reduktase-Komplex (KVORC1)
3.CYP4F2
Durch welches CYP-Enzym wird Clopidogrel, was zur Reinfarktprophylaxe angewendet wird, metabolisiert?
CYP2C19, bei Polymorphismus langsame/wenig Bidlung des aktiven Metaboliten
Durch welches Enzym wird 6-Mercaptopurin metabolisiert?
Thiopurin-S-Methyltransferase (TPMT) -> bei Polymorphismus kein Abbau in das unwirksame S-Methylmercaptopurin
Vemurafenib: AS gegen was? Wie wirkt es? (nicht so wichtig)
1. Darreichungsform: Filmtablette
2. Indikation: Monotherapie zur Behandlung von erwachsenen Patienten mit BRAF-
V600-Mutation-positivem nicht resezierbarem oder metastasiertem Melanom
3. IC50 Anti-Zellproliferation 0,016-1,131 µM (BRAF-V600) vs. 12,06-14,32 µM (BRAF)
Welche Mutation tritt bei vielen Melanomen auf?
BRAF Mutation -> BRAF V 600
Gegen was ist Ivacaftor ein Medikament?
Mukoviszidose
Luciferase
Reportergen, oxidative Enzyme, die Biolumineszenz produzieren -> Luciferine (Naturstoffe, die zur Erzeugung von Licht durch Biolumineszenz genutzt werden) mit Sauerstoff, ATP o. Magnesium -> Reaktion zu Oxoluciferin -> Zerfall -> Biolumineszenz, haben meist pH-Optimum bei 6,3
Reportergen
Gen, mit dem bestimmte Effekte/ Qualitäten anderer Gene gezeigt werden können
GFP
Grün-fluoreszierendes Protein: hat kein Chromophor als prosthetische Gruppe, bildet sich erst durch Umlagerung von AS in Position 65-67 bei UV-Anregung -> erst Ausbildung eines 5er Rings, dann Dehydratisierung, dann Oxidation mit Luftsauerstoff
Luciferase-Reportergen-Assay
benötigt Promotor, Luciferase Gen, Luciferin
Jacob-Monod-Modell der bakteriellen Genregulation
Operon mit Promotor, dass indirekt durch Repressor kontrolliert wird reguliert Proteinproduktion -> erst Wachstum der Kultur, dann Aufheben der Inhibition des Repressors -> Proteinproduktion
IPTG
Isopropyl-beta-D-thiogalactosid, künstliches Galactose-Derivat, dass als lac-Operon Induktor genutzt wird -> bindet an Repressor LacI, wodurch dessen inhibitorischer effekt durch Konformationsänderung aufgehoben wird -> Proteinproduktion
kann IPTG nicht durch Galactosidase gespalten werden
Bakterielle Wachstumskurve
lag: Anpassen an Kulturmedium
log: exponentielle Wachstumsphase
stationär: Sterben & Wachstum in GG, Kämpfen um Ressourcen
Multiplex-STR-Analyse
3% des humanen Genoms bestehen aus simple sequence repeats (SSR) aus sich wiederholenden Neukleotidsequenzen unterschiedlicher Länge (nichtkodierend -> kein Selektionsdruck) -> Länge der SSR = Maß der Individualität -> Unterteilung in Mini & Microsatelliten ->
Mikro: 100-400 bp lang, auch short tandem repeats (STR) genannt -> werden zur DNA-Typisierung, jedes Primer-Paar amplifiziert nur einen STR-Locus, Einsatz mehrerer Primer = mehrere STR-Loci werden erfasst -> Ergebnis: PCR-Fragmente unterschiedlicher Größe -> Trennung durch Elektrophorese => "Fingerabdruck"
Operon
Einheit von Genen, deren Genexpression gemeinsam reguliert wird (meistens bei Prokaryoten)
z.B. lac-Operon: werden gemeinsam auf derselben RNA translatiert (polycistronische RNA), Kontrolle der Expression durch Repressor, wenn der Metabolit, der von den Genprodukten eines Operons verstoffwechselt wird vorhanden, wird die Expression automatisch verstärkt
MCS
Multiple cloning region -> künstlich, viele Palindrome auf engem Raum
PCR
Polymerasekettenreaktion
benötigte Materialien: hitzestabile DNA-Polymerase (meist Taq-Polymerase), Mg2+(Cofaktor DNA-Polymerase), Primer, dNTPs (Desoxy-Nukleotide), template DNA, Puffer
95°C: Denaturierung -> Trennen in Einzelstränge
58°C: Annealing der Primer
75°C: DNA Synthese
"klassisches Reportergen" beta-Galactosidase
Blau-Weiß-Selektion
weiß: cDNA wahrscheinlich aufgenommen, da Galactosidase nicht funktionsfähig ist keine Blaufärbung
blau: Galactosidase intakt, X-Gal wird zu XY-Indigo gespalten -> Blaufärbung
Messung Estrogen-Rezeptor Aktivität mit Luciferase messen
Überprüfen, ob Substanz Estrogen-Rezeptor Agonist ist:
Falls Stoff an Estrogen-Rezeptor bindet, dann dissoziieren HSP ab, Dimerisierung, Wanderung in Zelle, aktivieren des Promotors durch beta-Estrogenrezeptor -> Luciferasegen wird exprimiert -> Luciferin, ATP & O2 zu Oxoluciferin katalysiert, was instabil ist, dann Lichtemission => Bestätigung, dass Agonist ist
FRET
Fluorescence resonance energy transfer -> strahlungsfreie Übertragung von Energie von energireichen, angeregten Farbstoff (Donor) auf zweiten Farbstoff, der dadurch zum Leuchten gebracht wird
Biopharmazeutika Definition
Arzneistoffe, die mithilfe gentechnisch veränderter Organismen hergestellt werden.
Dabei wird die für das benötigte Produkt kodierende DNA in eine geeignete Zelle eingeführt, in der diese DNA exprimiert und translatiert wird (Ph.Eur. Monographie "DNA-rekombinationstechnisch hergestellte Produkte")
Vergleich von chemisch-synthetisch hergestellen AS und Biopharmazeutika
Biotechnologie Definition
• (Industrieller) Prozess zur Produktion biologischer Materialien und Agentien durch die Ausnutzung und Optimierung natürlicherweise vorhandener Syntheseleistungen von Zellen
• gezielte Optimierung von Produktionsleistungen durch Veränderung der DNA durch gezielte Selektion und/oder ungerichtete Mutagenese durch Chemikalien, ultraviolette Strahlung oder durch ionisierende Strahlung
Beispiele für biotechnologisch hergestellte Produkte
monoklonale AK, rekombinante Proteine, Blutprodukte, Sera, Impfstoffe
Gentechnik Definition
ist eine Methodensammlung, die es erlaubt, aus einem Organismus DNA zu isolieren (Spender), neu zu kombinieren, in einen anderen Organismus einzubringen (Empfänger) und dort zur Wirkung zu bringen.
Was ist Transgenesis?
Das einbringen einer artfremden DNA
Welche Faustregel gilt bezüglich des Erfolges einer Klonation und der Größe der DNA?
Je kleiner die DNA, desto besser ist sie zu klonieren!
Herstellung DNA-rekombinatorischer Produkte laut Ph.Eur.
DNA-rekombinatorisch hergestellte Produkte werden durch genetische Modifikation hergestellt, bei der die für das benötigte Produkt kodierende DNA gewöhnlich mit Hilfe eines Plasmids oder viralen Vektors in einen geeigneten Mikroorganismus oder eine geeignete Zellinie eingeführt wird, in denen diese DNA exprimiert und translatiert wird. Das gewünschte Produkt wird dann durch Extraktion und Reinigung gewonnen. Die vor der Aufnahme des Vektors vorliegende Zelle oder der Mikroorganismus wird als Wirtszelle bezeichnet, die im Herstellungsprozess
verwendete stabile Verbindung der beiden als Wirt-Vektor-System
Was muss mit z.B. humaner DNA erst vorgenommen werden, bevor es in eine bakterielle Zelle eingeschleust werden kann?
Introns müssen rausgespliced werden, weil Bakterien keine Introns haben und damit nichts anfangen können
Wie wird die zu rekombinierende DNA aus dem Genom des jeweiligen Organismus rausgelöst, um dann mit einem geeigneten Promotor kombiniert werden zu können?
• PCR zum Isolieren der cDNA
• Schneiden von cDNA an spezifischen Stellen mit Restriktionsendonukleasen
• Ligation der cDNA in ein geeignetes Plasmid
• Amplifizieren erfolgreicher Ligation in Bakterienzellen
Restriktions-Endonukleasen und deren Aufgabe im Labor-Jargon
Restriktionsenzyme , Schnitte an bestimmten Stellen der DNA machen => verdauen
Welche Voraussetzung bezüglich der Enden von DNAs muss erfüllt sein, damit diese miteinander rekombiniert werden können?
sie müssen zusammenpassen
Wodurch kann DNA unspezifisch fragmentiert werden?
Durch Ultraschallbad
Restriktionsenzyme Funktion
- schneiden DNA an bestimmter Stelle (ausschließlich Doppelstrang DNA!) palindromisch => öffnen hierbei das Ribosephosphat-Rückgrat der DNA => Alle Bruchstrücke sehen dann gleich aus => verschiedene DNA-Moleküle (auch wenn sie aus verschiedenen
Organismen stammen!), die mit dem gleichen Restriktionsenzym geschnitten wurden, können wieder zusammengefügt – also rekombiniert – werden
siehe Bild: Einzelstrangbruch
DNA-Ligasen Funktion
verbinden DNA-Moleküle
Was versteht man unter einer Ligation?
Das Zusammenfügen zweier DNA-Fragmente (schließen einer Phosphodiesterbindung)
Vorteile und Nachteile von E. Coli als Klonier-Bakterium und als Wirtszelle zur Proteinherstellung
Vorteile:
• repliziert Plasmide natürlicherweise
• nicht pathogen, nicht mit Humanpathogenen infizierbar (z.B. viren)
• Genom komplett bekannt
• umfangreiche Erfahrung der Genetik
• nimmt leicht DNA auf
• schnelles Wachstum
• einfache Handhabung
• kostengünstige Medien
• Proteinproduktion leicht steuerbar
• hohe Proteinausbeuten
• einfaches Upscaling
• GRAS-Status (genetically recognized as safe): Wenn ein Organismus nicht auf dieser Liste ist, werden riesen Dossiers zur Zulassung benötigt, die die Sicherheit belegen
Nachteile:
• keine posttranslationalen Modifikationen
• Proteine oft nicht in der korrekten Tertiärstruktur
• Proteine oft denaturiert ("Inclusion bodies")
• Freisetzung von Pyrogenen => LPS aus Zellwand, gram -
• kaum Selektion von Proteinen
• Proteine, die N-Glykosilierungen oder andere posttranslationale Modifikationen für ihre Funktionalität benötigen können nicht in Bakterien hergestellt werden
Was ist ori?
origin of replication => Replikationsursprung, an dem die Zelle erkennt, dass es sich um eine replizierbare, aber extrachromosomale DNA handelt.
Wozu dienen Plasmide bei Bakterien?
zum horizontalen Gentransfer über Konjugation
Transformation von Bakterien
Methode, um fremde DNA in den Organismus zu bringen
andere Methode: mittels Elektroporation, erst 0°C, dann Feldstärke von 10-14 kV/cm anlegen mittels Kondensator => Strom durch die Zelle macht die Membran löchrig => Plasmidaufnahme => Ausbringen auf Selektionsagar
Auf dem Selektionsagar überleben nur die Zellen, die die Plasmide aufgenommen haben. Hierbei können sowohl leere Plasmide als auch solche mit der gewünschten rekombinierten DNA vorhanden
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Cartes-fiches
Wozu gehören Hefen in der Systematik der Lebewesen?
einzellige Pilze
Vorteile für Hefen zur Proteinproduktion
• echter Eukaryont
• schnelles Wachstum
• umfangreiche Erfahrung mit Hefe-Genetik
• Genom vollständig bekannt
• Zellen und deren Produkte sind nicht pathogen
• Zellen produzieren keine Pyrogene
• meist korrekte Faltung der exprimierten Proteine
• zum Teil hohe Proteinausbeuten
• Sekretion in das Kulturmedium
• einige posttranslationale Modifikationen sind machbar
• biologisch sicher (genetically recognized as safe, GRAS)
• nimmt relativ leicht DNA auf
• einfache Handhabung
• kostengünstige Medien
Hefen: Besonderheiten bzgl. Glykosylierungen
• Glykosylierungen nur über den sekretorischen Weg hergestellt und sekretiert werden
• kaum Prozessierung von RNA (d.h. Introns müssen aus humanen Genen entfernt werden)
• Antibiotika-Selektion nur bedingt einsetzbar
• Selektion über Auxotrophie-Marker (Kann bestimmte essentielle Substanz nicht selbst produzieren)
• N-Glykosylierungen sind stark verschieden von Säugerzellen
o High Mannose-Typ (Man6-9GlcNAc2; Hypermannosylierung:
ManxGlcNAc2 >100 Mannose-Einheiten); es gibt Produktionsstämme mit inaktivierter α1,3-Mannosyltransferase
o terminale Mannose α1,3 (α1,2 in Säugerzellen)
o stark antigen
o erhöhte Clearance
• Wenn tierische Proteine N-Glykosylierungen für ihre Funktionalität brauchen, können sie in Hefe in der Regel nicht oder nur eingeschränkt hergestellt werden
Was heißt "methylotroph2
Organismus ist in der Lage reduzierte C1-Moleküle wie z.B. Methanol oder Methan als Kohlenstoffquelle nutzen und dieses verwerten
Welche Methylotrophe Hefe wird oft verwendet?
Pichia pastoris
Vorteile Pichia pastoris
• bringt höhere Expressionsraten als S. cerevisiae
• wächst auf Methanol als alleiniger C-Quelle (fakultativ methylotrophe Hefe)
• genetisch ähnlich gut manipulierbar wie S. cerevisiae
• starke, durch Methanol induzierbare Promotoren (AOX1, FLD1)*
• N-Glykosylierungen enthalten wesentlich weniger Mannosereste (terminale
Mannose α1,2 statt α1,3)
Vorteile und Nachteile von Pflanzen in der Proteinproduktion
Vorteile
• große Erfahrungen aus der traditionellen Pflanzenzüchtung
• Selbstbefruchtung
• Regenerationsfähigkeit
• billige Kultivierung und Lagerung
• beliebiges "Upscaling" durch Feldanbau
• frei von humanen Pathogenen (insbesondere Viren)
Nachteile:
• Sekundäre Zellwand
• Polyploidie
• somaklonale Variation
• geringe Produktmengen
• falsche Glykosylierung: simple N-Glykane ohne Sialinsäure, ungewöhnliche Verknüpfungen, z.B. α1-3-verknüpfte Fucose statt α1-6- Verknüpfung und Xylose(β1-2)Mannose
• "Gene silencing"
• rekombinantes Protein ist im Cytosol in der Regel instabil
• aufwändige Reinigung der Produkte
• spezielle regulatorische Anforderungen an "Freisetzung" transgener Pflanzen
• bei Feldanbau keine GMP-Bedingungen in der Produktion
Was ist Agrobacterium und wofür wird es verwendet?
ein Phytopathogen, als biologisches Gentransfer-System
Was ist auf dem Ti-Plasmid des Agrobacteriums codiert und was macht das ganze? Wofür steht das TI?
ti: tumor induzierend
o großes, komplexes Plasmid (ca. 200.000 bp)
o T-DNA (Transfer-Gene):
- kodiert die Synthese und Abbau sog. Opine
- kodiert Enzyme, die die Synthese von Auxinen und Cytokininen in der Pflanze katalysieren
o Vir-Gene (Virulenz-Gene)
- Expression im Bakterium induziert durch "Lockstoffe" aus der pflanzlichen Wundreaktion
- kodieren u.a. Enzyme für die Übertragung der T-DNA in die Pflanzenzelle
Die Gene des Ti-Plasmides ermöglichen es Agrobakterien, DNA in Pflanzenzellen zu übertragen und diese genetisch zu verändern. Sie lösen tumorartige Wucherungen und damit Pflanzenkrankheiten aus.
Was sind Opine?
Opine kommen in der Natur hauptsächlich in marinen Invertebraten vor, aber auch in genetisch veränderten Pflanzenzellen. Die Transfektion der pflanzlichen Zellen wird durch Agrobakterien ausgelöst, das heißt, die Bakterien übertragen die Gene für die Opinsynthese in die Pflanzenzelle. Pflanzen ist es nicht möglich, Opine zu verwerten – den in den Pflanzen lebenden Bakterien dienen sie jedoch als Kohlenstoff-, Stickstoff- und Energiequelle. Dabei induziert und verwertet jeder Agrobacterium-Stamm seine eigenen Opine. Die Gene für die Opinsynthese befinden sich auf einem speziellen Plasmid, dem sogenannten Ti-Plasmid.
Ablauf bei Transformation bzw. Transfektion mittels Gene Gun
Glykosylierung von Pflanzen im Vergleich zu High Mannose und Komplexem Typ
Welche Tiere/Zelltypen infizieren Baculoviren?
ausschließlich Invertebraten (Wirbellose), v.a. Insektenzellen
Baculovirus Eigenchaften
• DNA-Virus
• infiziert nur Invertebraten, vor allem Insektenzellen (wichtig als biologischer Sicherheitsstandard in der biotechnologischen Produktion)
• Genom Doppelstrang-DNA 90.000-230.000 bp, zirkulär
• Nucleokapside 200-450 nm lang;
• 30-100 nm im Durchmesser
• intrazelluläre Akkumulation von Virus-Paketen, die in eine Polyhedrin-Matrix eingeschlossen (okkludiert) sind
• Polyhedrin-Synthese beginnt 36-48 h nach Infektion und dauert 4-5 Tage an
• Autographa californica Multiple Nucleopolyhedrovirus (AcMNPV)
o infiziert über 40 Insektenarten und auch Insekten-Zelllinien
o typische Produktionszelllinien für Herstellung rekombinanter Proteine:
Sf9, Sf21 (abgeleitet von Spodoptera fugiperda)
Proteinproduktion in Insektenzellen
• Nutzung eines kombinierten AcMNPV- und Transfer-Vektorsystems
• Nutzung des extrem starken Polyhedrin-Promotors
• Expression sehr großer Mengen eines nativen, rekombinanten Proteins (bis zu 500 mg pro Liter)
• Glykosylierungen sind meist Oligomannose (Man3-9GlcNAc2), in Trichoplysiani z.T. auch komplexere Glycane mit Sialinsäure
• transientes Expressionssystem: Produktion beginnt 36-48 h nach Infektion und dauert 4-5 Tage an
• relativ weit entwickelt ist die Produktion von Proteinen in Zellkulturen von Drosophila melanogaster (Fruchtfliege)
o Nutzung normaler Transfektionsmethoden
o erste Proteinexpression bereits zwei Tage nach Transfektion
o Etablierung stabiler Zelllinien
o stabile Zelllinien nach zwei Wochen
o Promotoren: Drosophila Metallothionein (MT) oder Drosophila Aktin 5C (Ac5)
o typische Produktionszelllinie für Herstellung rekombinanter Proteine: S2
o S2-Zellen wachsen bei Raumtemperatur; brauchen keine CO2- Begasung (wie Säugerzellen)
o Medien wesentlich billiger als für Säugerzellen
o Produktion unter GMP-Bedingungen
Cervarix®
- Indikation: Impfung gegen Humane Papillomviren, Impfschema: nach 0, 1 und 6 Monate bei Mädchen 12-17 Jahre (lt. STIKO-Empfehlung) => Prävention prämaligner Läsionen der Zervix und von Zervixkarzinomen
- Wirkmechanismus: enthält je 20 μg des L1-Proteins von HPV-16 und HPV 18
- Herstellung:
• Vektor: rekombinantes Baculovirus
• Wirtszelle: Hi-5 Rix4446-Zellen aus Trichoplusia ni
Flublok®
- Indikation: Impfung gegen saisonale Influenza, jeweils 45 μg HA pro Impfdosis
- Wirkmechanismus: rekombinanter, trivalenter Influenza-Impfstoff, Hämagglutinin (HA) von H1N1, H3N2 und B
- Herstellung:
• hergestellt in Sf9-Zelllinie (expressSF+®) aus Spodoptera fugiperda
• Expressionssystem schnell an saisonale Influenza-Stämme anpassbar
• keine Produktion in Hühner-Eiern => geeignet für Hühnereiweiß-Allergiker
• keine Anzucht kompletter Influenza-Viren
• skalierbar
Stärken und Schwächen von Säugetierzellen in der Proteinproduktion
Stärken
• sehr nahe am "humanen System"
• korrekte Faltung auch komplexer Proteine
• Sekretion in das Kulturmedium
• (fast) authentische posttranslationale Modifikationen
Schwächen
• teure Medien
• langsames Wachstum
• hohe Investitionskosten für Fermentation
• hohe Produktionskosten
• hohe Lagerungskosten für Master-Zelllinien
• "Upscaling" ist schwierig
• möglicherweise anfällig für humane Pathogene (vor allem Viren)
• relativ geringe Proteinmengen produzierbar
Welches an der Glykosylierung beteiligte Enzym haben Hamster- und Maus-Zelllinien, aber Menschen, Menschenaffen und Altwelt-Affen nicht? Welche Auswirkung hat das? Wie wird dieses Problem bei CHO-Zellen umgangen?
α1,3-Galactosyltransferase => daraus resultiert terminales Gal(α1,3)Gal(β1,4)GlcNAc
=> Gal(α1,3)Gal(β1,4)GlcNAc ist stark antigen
o Gen für α1,3-Galactosyltransferase ist in CHO-Zelllinien inaktiviert
anderes Wort für Sialinsäure
N-Acetyl-Neuraminsäure
Was machen transgene Tiere?
exprimieren eines oder mehrere Fremdgene
Knock-out Tiere
haben eine Mutation in einem bestimmten Gen
Einsatzgebiete von transgenen und knock-out-Tieren
• In der Forschung:
o Identifizierung von Genfunktionen
• Biotechnologische Anwendungen:
o Produktion von Proteinwirkstoffen
o Produktion von Medizinprodukten
o Produktion tierischer Organe für Transplantationszwecke
Methoden zur Erzeugung transgener Tiere
• Retrovirale Transduktion
• DNA-Mikroinjektion
• Spermien-vermittelter Gentransfer
• Stammzell-Technologie
• Somatischer Kerntransfer
Funktionsweise Mikroinjektion
• direkte Injektion der rekombinanten DNA in den männlichen Vorkern (Spermium in Eizelle, aber noch nicht mit dieser verschmolzen) einer befruchteten Eizelle
• nicht in jedem resultierendem Embryo wird die transgene DNA in das Genom integriert und geht verloren
• Folge: man muss aufwändig durch Rückkreuzungen testen, welche Nachkommen die transgene DNA in der Keimbahn tragen
• um zu überprüfen, ob ein Nachkomme das Transgen in der Keimbahn trägt, also weitervererben kann, werden die Tiere mit normalen Tieren gekreuzt. Nach Mendel sollte sich das Transgen auf 50% der Nachkommen vererben.
Chorea Huntington
• autosomal-dominant vererbt
• Prävalenz ca. 1:10.000-1:20.000
• Progressive neurodegenerative Krankheit
• keine kausale Therapie möglich
• 100% Sterblichkeit
• Ausbruch der Krankheit erst nach 30-45 Jahren
• Trinukleotid-Expansions-Mutation
o betroffenes Protein: Huntingtin
o (CAG)n-Wiederholungen (Glutamin-Wiederholungen)
o (CAG)9-35 ist normal, (CAG)37-100 ist pathologisch
• Zeitpunkt des Ausbrechens und Schwere der Krankheit korrelieren invers mit der Repeat-Zahl => je mehr Repeats, desto früher bricht die Krankheit aus und desto schwerer ist die Krankheit
"Pharming"
Anwendung transgener Tiere für die Herstellung therapeutischer Proteine
Transgene Milch
Das Euter einer Kuh ist ein geradezu idealer "Bioreaktor" für die Herstellung von
Proteinen, ist es doch natürlicherweise dazu befähigt, große Mengen Proteine in
hoher Konzentration in die Milch zu sezernieren.
• Zelldichte 1000-fach höher als in Säugerzellkulturen
• Milchdrüsenzellen führen authentische posttranslationale Modifikationen durch (insbesondere Glykosylierungen)
• 2-10 Gramm pro Liter rekombinantes Protein sind möglich (nur 0,2-1 g/l in Zellkulturen)
• lebenslange, kontinuierliche Produktion während der Laktationsphase der Tiere
• Fremdgene werden unter Kontrolle des β-Lactoglobulin-Promotors in Milchdrüsenzellen exprimiert
gängige Tiere für Milchproduktion
• Kaninchen
o kurze Dauer der Trächtigkeit
o relativ geringe Haltungskosten
o bis zu 20 g/l rekombinantes Protein in Milch
o 0,5-1 kg rekombinantes Protein pro Jahr
• Schaf und Ziege
o kurze Trächtigkeit und Zeit bis zur Geschlechtsreife
o geringe Größe der Tiere verursacht relativ geringe Haltungskosten
o relativ hohe Milchleistung
- 2,5 Liter Milch/Tag
- 1-8 kg reines rProtein/Jahr
• Kuh
o Milchleistung einer Kuh bis zu 10.000 Liter pro Jahr
o Protein 1-10 g/l
o bis 100 kg rekombinantes Protein pro Jahr
Antithrombin alfa ( Antithrombin III, ATryn®)
- Indikation: Prophylaxe einer venösen Thromboembolie bei chirurgischen Eingriffen an erwachsenen Patienten mit erblich bedingtem Antithrombinmangel, durch BfArM mit schwarzem Dreieck auf der Spitze gekennzeichnet, da es unter außergewöhnlichen Zuständen zugelassen wurde => steht unter Beobachtung post-Zulassung, da nicht genug Informationen zur Verfügung standen zum Zeitpunkt der Zulassung (nur in kleinen Gruppen getestet)
- Wirkmechanismus: Hemmung von Thrombin => Hemmung der Blutgerinnung
- Herstellung: produziert in der Milch transgener Ziegen (1-4 g/L), jüber transgene Mikroinjektion
Gewinnung von Knockout-Zellen Gene Replacement
Vorteil von in vitro Transfektion: Selektionsprozess kann ausgeschlossen werden
mit einem Gene-Replacement Vektor kann ein Gen im Genom gezielt zerstört werden. Dabei wird ein Bereich des Zielgens durch eine andere Funktionseinheit, z.B. Neomycin-Resistenz, ersetzt. Dazu muss der Selektionsmarker auf beiden Seiten von DNA-Sequenzen des Zielgens umgeben sein- Es ist jeweils ein separates Rekombinationsereignis in beiden Homologiebereichen notwendig.
Theorie (vll ist das ja echt so): gewünschter Abschnitt, der auf dem Plasmid vorhanden ist, wird in das Gen der Zellen homolog rekombiniert (dazu müssen die Enden des Gens komplementär zu den Stellen auf dem Gen sein). Daraufhin wird es auf einen Selektionsagar aufgetragen, wo nur die rekombinierten Zellen überleben...
Eigenschaften transgener Stammzellen
• diploid
• unbegrenzt proliferationsfähig
• genetisch embryonal oder fötal
• nicht differenziert
• fähig zur Bildung vieler Zelltypen (pluripotent)
• gentechnisch veränderbar
Darstellung Embryogenese und ab wann welche Arten von Stammzellen vorliegen
Was versteht man unter Mosaiktieren?
chimäre Tiere => transgene Mäuse
Vorgehensweise bei der Erzeugung chimärer Mäuse:
o Verpaaren von Mäuren
o Isolieren der Embryonen im Blastozystenstadium
o Isolieren der "Inneren Zellmasse" (Embyroblast); diese Zellen können in Kultur wachsen und werden dann Embyronale Stammzellen genannt
o diese Embryonalen Stammzellen werden mit konventionellen Methoden transfiziert und dann getestet, ob sie das Transgen auch exprimieren
o solche transgenen Stammzellen werden dann in eine andere Blastozyste injiziert
o dort integrieren sich die transgenen Stammzellen in den entstehenden Embryo
o die resultierenden Tiere sind Mosaike aus den Zellen unterschiedlicher Herkunft; dabei können die transgenen Zellen zur Bildung aller Körpergewebe beitragen (also auch den Keimzellen)
Mendelsche Regeln
1. Uniformitätsregel: Wenn zwei Eltern miteinander gepaart werden, die sich in einem Merkmal unterscheiden und jeweils homozygot sind, so ist die F1-Generation (Tochtergeneration) heterozygot und sowohl phänotypisch als auch genotypisch gleich.
- bei Dominant-rezessiven: alle haben Phänotyp vom dominanten
- intermediär: Mischfarbe
- kodominant: keine Mischfarbe, sondern vollständige Ausprägung beider Merkmale
2, Spaltungsregel: Bei Kreuzung der F1-Generation treten die jeweiligen Merkmale in bestimmtem Zahlenverhältnis in der F2-Generation auf.
- dominant-rezessiv: Dr, Rd, DD, RR => 3/4 sind rot, da rot dominant vererbt wird und 1/4 sind weiß, weil sie homozygot für das rezessive Gen sind
- intermediär: DD, RR, Dr,Dr => 1/2 sind mischfarben, jeweils 1/4 sind rein
3. Unabhängigkeitsregel: Kreuzt man zwei Rassen, die sich in mehreren Merkmalen unterscheiden, so werden die einzelnen Erbanlagen unabhängig voneinander vererbt. Diese Erbanlagen können sich neu kombinieren. Gilt nur dann, wenn die Gene für die Merkmale auf unterschiedlichen Chromosomen liegen
Quellen für humane adulte Stammzellen
Erwachsene,
Nabelschnurblut => besseres Proliferationsvermögen:
• sehr junge adulte Stammzellen
• Potenzial noch nicht gut untersucht
• ethisch unbedenklich
• werden direkt nach der Geburt eines Kindes entnommen
Quellen für humane pluripotente Stammzellen
Blastozysten
induzierte pluripotente Stammzellen aus Zellkulturen
Gewinnung humaner embryonaler Stammzellen
durch Entnehmen des Embryoblasts bei einer in vitro Fertilisation
Wozu können pluripotente Stammzellen nicht verwendet werden?
Zur Bildugn eines neuen Organismus, da sie sich nicht in Trophoblasten differenzieren können
