Biopharmazeutika

mehrere relevante Polymorphismen:
1. CYP2C9
2.Vitamin-K-Epoxid-Reduktase-Komplex (KVORC1)
3.CYP4F2

CYP2C19, bei Polymorphismus langsame/wenig Bidlung des aktiven Metaboliten

Thiopurin-S-Methyltransferase (TPMT) -> bei Polymorphismus kein Abbau in das unwirksame S-Methylmercaptopurin

1. Darreichungsform: Filmtablette
2. Indikation: Monotherapie zur Behandlung von erwachsenen Patienten mit BRAF-
V600-Mutation-positivem nicht resezierbarem oder metastasiertem Melanom
3. IC50 Anti-Zellproliferation 0,016-1,131 µM (BRAF-V600) vs. 12,06-14,32 µM (BRAF)

BRAF Mutation -> BRAF V 600

Mukoviszidose

Reportergen, oxidative Enzyme, die Biolumineszenz produzieren -> Luciferine (Naturstoffe, die zur Erzeugung von Licht durch Biolumineszenz genutzt werden) mit Sauerstoff, ATP o. Magnesium -> Reaktion zu Oxoluciferin -> Zerfall -> Biolumineszenz, haben meist pH-Optimum bei 6,3

Gen, mit dem bestimmte Effekte/ Qualitäten anderer Gene gezeigt werden können

Grün-fluoreszierendes Protein: hat kein Chromophor als prosthetische Gruppe, bildet sich erst durch Umlagerung von AS in Position 65-67 bei UV-Anregung -> erst Ausbildung eines 5er Rings, dann Dehydratisierung, dann Oxidation mit Luftsauerstoff

benötigt Promotor, Luciferase Gen, Luciferin

Operon mit Promotor, dass indirekt durch Repressor kontrolliert wird reguliert  Proteinproduktion -> erst Wachstum der Kultur, dann Aufheben der Inhibition des Repressors -> Proteinproduktion

Isopropyl-beta-D-thiogalactosid, künstliches Galactose-Derivat, dass als lac-Operon Induktor genutzt wird -> bindet an Repressor LacI, wodurch dessen inhibitorischer effekt durch Konformationsänderung aufgehoben wird -> Proteinproduktion

kann IPTG nicht durch Galactosidase  gespalten werden

lag: Anpassen an Kulturmedium

log: exponentielle Wachstumsphase

stationär: Sterben & Wachstum in GG, Kämpfen um Ressourcen 

3% des humanen Genoms bestehen aus simple sequence repeats (SSR) aus sich wiederholenden Neukleotidsequenzen unterschiedlicher Länge (nichtkodierend -> kein Selektionsdruck) -> Länge der SSR = Maß der Individualität -> Unterteilung in Mini & Microsatelliten ->

Mikro: 100-400 bp lang, auch short tandem repeats (STR) genannt -> werden zur DNA-Typisierung, jedes Primer-Paar amplifiziert nur einen STR-Locus, Einsatz mehrerer Primer = mehrere STR-Loci werden erfasst -> Ergebnis: PCR-Fragmente unterschiedlicher Größe -> Trennung durch Elektrophorese => "Fingerabdruck"

Einheit von Genen, deren Genexpression gemeinsam reguliert wird (meistens bei Prokaryoten)

z.B. lac-Operon: werden gemeinsam auf derselben RNA translatiert (polycistronische RNA), Kontrolle der Expression durch Repressor, wenn der Metabolit, der von den Genprodukten eines Operons verstoffwechselt wird vorhanden, wird die Expression automatisch verstärkt

Multiple cloning region -> künstlich, viele Palindrome auf engem Raum

Polymerasekettenreaktion

benötigte Materialien: hitzestabile DNA-Polymerase (meist Taq-Polymerase), Mg²⁺(Cofaktor DNA-Polymerase), Primer, dNTPs (Desoxy-Nukleotide), template DNA, Puffer

95°C: Denaturierung -> Trennen in Einzelstränge

58°C: Annealing der Primer

75°C: DNA Synthese

Blau-Weiß-Selektion

weiß: cDNA wahrscheinlich aufgenommen, da Galactosidase nicht funktionsfähig ist keine Blaufärbung

blau: Galactosidase intakt, X-Gal wird zu XY-Indigo gespalten -> Blaufärbung

Überprüfen, ob Substanz Estrogen-Rezeptor Agonist ist:

Falls Stoff an Estrogen-Rezeptor bindet, dann dissoziieren HSP ab, Dimerisierung, Wanderung in Zelle, aktivieren des Promotors durch beta-Estrogenrezeptor -> Luciferasegen wird exprimiert -> Luciferin, ATP & O₂ zu Oxoluciferin katalysiert, was instabil ist, dann Lichtemission => Bestätigung, dass Agonist ist

Fluorescence resonance energy transfer -> strahlungsfreie Übertragung von Energie von energireichen, angeregten Farbstoff (Donor) auf zweiten Farbstoff, der dadurch zum Leuchten gebracht wird

• (Industrieller) Prozess zur Produktion biologischer Materialien und Agentien durch die Ausnutzung und Optimierung natürlicherweise vorhandener Syntheseleistungen von Zellen
• gezielte Optimierung von Produktionsleistungen durch Veränderung der DNA durch gezielte Selektion und/oder ungerichtete Mutagenese durch Chemikalien, ultraviolette Strahlung oder durch ionisierende Strahlung

monoklonale AK, rekombinante Proteine, Blutprodukte, Sera, Impfstoffe

ist eine Methodensammlung, die es erlaubt, aus einem Organismus DNA zu isolieren (Spender), neu zu kombinieren, in einen anderen Organismus einzubringen (Empfänger) und dort zur Wirkung zu bringen.

Das einbringen einer artfremden DNA

Je kleiner die DNA, desto besser ist sie zu klonieren!

DNA-rekombinatorisch hergestellte Produkte werden durch genetische Modifikation hergestellt, bei der die für das benötigte Produkt kodierende DNA gewöhnlich mit Hilfe eines Plasmids oder viralen Vektors in einen geeigneten Mikroorganismus oder eine geeignete Zellinie eingeführt wird, in denen diese DNA exprimiert und translatiert wird. Das gewünschte Produkt wird dann durch Extraktion und Reinigung gewonnen. Die vor der Aufnahme des Vektors vorliegende Zelle oder der Mikroorganismus wird als Wirtszelle bezeichnet, die im Herstellungsprozess
verwendete stabile Verbindung der beiden als Wirt-Vektor-System

Introns müssen rausgespliced werden, weil Bakterien keine Introns haben und damit nichts anfangen können

• PCR zum Isolieren der cDNA
• Schneiden von cDNA an spezifischen Stellen mit Restriktionsendonukleasen
• Ligation der cDNA in ein geeignetes Plasmid 

• Amplifizieren erfolgreicher Ligation in Bakterienzellen

Restriktionsenzyme , Schnitte an bestimmten Stellen der DNA machen => verdauen

sie müssen zusammenpassen

Durch Ultraschallbad

- schneiden DNA an bestimmter Stelle (ausschließlich Doppelstrang DNA!) palindromisch => öffnen hierbei das Ribosephosphat-Rückgrat der DNA => Alle Bruchstrücke sehen dann gleich aus => verschiedene DNA-Moleküle (auch wenn sie aus verschiedenen
Organismen stammen!), die mit dem gleichen Restriktionsenzym geschnitten wurden, können wieder zusammengefügt – also rekombiniert – werden

siehe Bild: Einzelstrangbruch

verbinden DNA-Moleküle

Das Zusammenfügen zweier DNA-Fragmente (schließen einer Phosphodiesterbindung)

Vorteile:

• repliziert Plasmide natürlicherweise
• nicht pathogen, nicht mit Humanpathogenen infizierbar (z.B. viren)
• Genom komplett bekannt
• umfangreiche Erfahrung der Genetik
• nimmt leicht DNA auf
• schnelles Wachstum
• einfache Handhabung

• kostengünstige Medien
• Proteinproduktion leicht steuerbar
• hohe Proteinausbeuten
• einfaches Upscaling
• GRAS-Status (genetically recognized as safe): Wenn ein Organismus nicht auf dieser Liste ist, werden riesen Dossiers zur Zulassung benötigt, die die Sicherheit belegen

Nachteile: 

• keine posttranslationalen Modifikationen
• Proteine oft nicht in der korrekten Tertiärstruktur
• Proteine oft denaturiert ("Inclusion bodies")
• Freisetzung von Pyrogenen => LPS aus Zellwand, gram -

• kaum Selektion von Proteinen

• Proteine, die N-Glykosilierungen oder andere posttranslationale Modifikationen für ihre Funktionalität benötigen können nicht in Bakterien hergestellt werden

origin of replication => Replikationsursprung, an dem die Zelle erkennt, dass es sich um eine replizierbare, aber extrachromosomale DNA handelt.

zum horizontalen Gentransfer über Konjugation

Methode, um fremde DNA in den Organismus zu bringen

andere Methode: mittels Elektroporation, erst 0°C, dann Feldstärke von 10-14 kV/cm anlegen mittels Kondensator => Strom durch die Zelle macht die Membran löchrig => Plasmidaufnahme => Ausbringen auf Selektionsagar

Auf dem Selektionsagar überleben nur die Zellen, die die Plasmide aufgenommen haben. Hierbei können sowohl leere Plasmide als auch solche mit der gewünschten rekombinierten DNA vorhanden