Biopharmazeutika
Grundlagen Gentechnik, Herstellung Proteinwirkstoffe
Grundlagen Gentechnik, Herstellung Proteinwirkstoffe
Durch welche Polymorphismen wird das Blutungsrisiko bei Therapie mit Vitamin-K-Antagonisten erhöht? Mechanismus!
mehrere relevante Polymorphismen:
1. CYP2C9
2.Vitamin-K-Epoxid-Reduktase-Komplex (KVORC1)
3.CYP4F2
Durch welches CYP-Enzym wird Clopidogrel, was zur Reinfarktprophylaxe angewendet wird, metabolisiert?
CYP2C19, bei Polymorphismus langsame/wenig Bidlung des aktiven Metaboliten
Durch welches Enzym wird 6-Mercaptopurin metabolisiert?
Thiopurin-S-Methyltransferase (TPMT) -> bei Polymorphismus kein Abbau in das unwirksame S-Methylmercaptopurin
Vemurafenib: AS gegen was? Wie wirkt es? (nicht so wichtig)
1. Darreichungsform: Filmtablette
2. Indikation: Monotherapie zur Behandlung von erwachsenen Patienten mit BRAF-
V600-Mutation-positivem nicht resezierbarem oder metastasiertem Melanom
3. IC50 Anti-Zellproliferation 0,016-1,131 µM (BRAF-V600) vs. 12,06-14,32 µM (BRAF)
Welche Mutation tritt bei vielen Melanomen auf?
BRAF Mutation -> BRAF V 600
Gegen was ist Ivacaftor ein Medikament?
Mukoviszidose
Luciferase
Reportergen, oxidative Enzyme, die Biolumineszenz produzieren -> Luciferine (Naturstoffe, die zur Erzeugung von Licht durch Biolumineszenz genutzt werden) mit Sauerstoff, ATP o. Magnesium -> Reaktion zu Oxoluciferin -> Zerfall -> Biolumineszenz, haben meist pH-Optimum bei 6,3
Reportergen
Gen, mit dem bestimmte Effekte/ Qualitäten anderer Gene gezeigt werden können
GFP
Grün-fluoreszierendes Protein: hat kein Chromophor als prosthetische Gruppe, bildet sich erst durch Umlagerung von AS in Position 65-67 bei UV-Anregung -> erst Ausbildung eines 5er Rings, dann Dehydratisierung, dann Oxidation mit Luftsauerstoff
Luciferase-Reportergen-Assay
benötigt Promotor, Luciferase Gen, Luciferin
Jacob-Monod-Modell der bakteriellen Genregulation
Operon mit Promotor, dass indirekt durch Repressor kontrolliert wird reguliert Proteinproduktion -> erst Wachstum der Kultur, dann Aufheben der Inhibition des Repressors -> Proteinproduktion
IPTG
Isopropyl-beta-D-thiogalactosid, künstliches Galactose-Derivat, dass als lac-Operon Induktor genutzt wird -> bindet an Repressor LacI, wodurch dessen inhibitorischer effekt durch Konformationsänderung aufgehoben wird -> Proteinproduktion
kann IPTG nicht durch Galactosidase gespalten werden
Bakterielle Wachstumskurve
lag: Anpassen an Kulturmedium
log: exponentielle Wachstumsphase
stationär: Sterben & Wachstum in GG, Kämpfen um Ressourcen
Multiplex-STR-Analyse
3% des humanen Genoms bestehen aus simple sequence repeats (SSR) aus sich wiederholenden Neukleotidsequenzen unterschiedlicher Länge (nichtkodierend -> kein Selektionsdruck) -> Länge der SSR = Maß der Individualität -> Unterteilung in Mini & Microsatelliten ->
Mikro: 100-400 bp lang, auch short tandem repeats (STR) genannt -> werden zur DNA-Typisierung, jedes Primer-Paar amplifiziert nur einen STR-Locus, Einsatz mehrerer Primer = mehrere STR-Loci werden erfasst -> Ergebnis: PCR-Fragmente unterschiedlicher Größe -> Trennung durch Elektrophorese => "Fingerabdruck"
Operon
Einheit von Genen, deren Genexpression gemeinsam reguliert wird (meistens bei Prokaryoten)
z.B. lac-Operon: werden gemeinsam auf derselben RNA translatiert (polycistronische RNA), Kontrolle der Expression durch Repressor, wenn der Metabolit, der von den Genprodukten eines Operons verstoffwechselt wird vorhanden, wird die Expression automatisch verstärkt
MCS
Multiple cloning region -> künstlich, viele Palindrome auf engem Raum
PCR
Polymerasekettenreaktion
benötigte Materialien: hitzestabile DNA-Polymerase (meist Taq-Polymerase), Mg2+(Cofaktor DNA-Polymerase), Primer, dNTPs (Desoxy-Nukleotide), template DNA, Puffer
95°C: Denaturierung -> Trennen in Einzelstränge
58°C: Annealing der Primer
75°C: DNA Synthese
"klassisches Reportergen" beta-Galactosidase
Blau-Weiß-Selektion
weiß: cDNA wahrscheinlich aufgenommen, da Galactosidase nicht funktionsfähig ist keine Blaufärbung
blau: Galactosidase intakt, X-Gal wird zu XY-Indigo gespalten -> Blaufärbung
Messung Estrogen-Rezeptor Aktivität mit Luciferase messen
Überprüfen, ob Substanz Estrogen-Rezeptor Agonist ist:
Falls Stoff an Estrogen-Rezeptor bindet, dann dissoziieren HSP ab, Dimerisierung, Wanderung in Zelle, aktivieren des Promotors durch beta-Estrogenrezeptor -> Luciferasegen wird exprimiert -> Luciferin, ATP & O2 zu Oxoluciferin katalysiert, was instabil ist, dann Lichtemission => Bestätigung, dass Agonist ist
FRET
Fluorescence resonance energy transfer -> strahlungsfreie Übertragung von Energie von energireichen, angeregten Farbstoff (Donor) auf zweiten Farbstoff, der dadurch zum Leuchten gebracht wird
Biopharmazeutika Definition
Arzneistoffe, die mithilfe gentechnisch veränderter Organismen hergestellt werden.
Dabei wird die für das benötigte Produkt kodierende DNA in eine geeignete Zelle eingeführt, in der diese DNA exprimiert und translatiert wird (Ph.Eur. Monographie "DNA-rekombinationstechnisch hergestellte Produkte")
Vergleich von chemisch-synthetisch hergestellen AS und Biopharmazeutika
Biotechnologie Definition
• (Industrieller) Prozess zur Produktion biologischer Materialien und Agentien durch die Ausnutzung und Optimierung natürlicherweise vorhandener Syntheseleistungen von Zellen
• gezielte Optimierung von Produktionsleistungen durch Veränderung der DNA durch gezielte Selektion und/oder ungerichtete Mutagenese durch Chemikalien, ultraviolette Strahlung oder durch ionisierende Strahlung
Beispiele für biotechnologisch hergestellte Produkte
monoklonale AK, rekombinante Proteine, Blutprodukte, Sera, Impfstoffe
Gentechnik Definition
ist eine Methodensammlung, die es erlaubt, aus einem Organismus DNA zu isolieren (Spender), neu zu kombinieren, in einen anderen Organismus einzubringen (Empfänger) und dort zur Wirkung zu bringen.
Was ist Transgenesis?
Das einbringen einer artfremden DNA
Welche Faustregel gilt bezüglich des Erfolges einer Klonation und der Größe der DNA?
Je kleiner die DNA, desto besser ist sie zu klonieren!
Herstellung DNA-rekombinatorischer Produkte laut Ph.Eur.
DNA-rekombinatorisch hergestellte Produkte werden durch genetische Modifikation hergestellt, bei der die für das benötigte Produkt kodierende DNA gewöhnlich mit Hilfe eines Plasmids oder viralen Vektors in einen geeigneten Mikroorganismus oder eine geeignete Zellinie eingeführt wird, in denen diese DNA exprimiert und translatiert wird. Das gewünschte Produkt wird dann durch Extraktion und Reinigung gewonnen. Die vor der Aufnahme des Vektors vorliegende Zelle oder der Mikroorganismus wird als Wirtszelle bezeichnet, die im Herstellungsprozess
verwendete stabile Verbindung der beiden als Wirt-Vektor-System
Was muss mit z.B. humaner DNA erst vorgenommen werden, bevor es in eine bakterielle Zelle eingeschleust werden kann?
Introns müssen rausgespliced werden, weil Bakterien keine Introns haben und damit nichts anfangen können
Wie wird die zu rekombinierende DNA aus dem Genom des jeweiligen Organismus rausgelöst, um dann mit einem geeigneten Promotor kombiniert werden zu können?
• PCR zum Isolieren der cDNA
• Schneiden von cDNA an spezifischen Stellen mit Restriktionsendonukleasen
• Ligation der cDNA in ein geeignetes Plasmid
• Amplifizieren erfolgreicher Ligation in Bakterienzellen
Restriktions-Endonukleasen und deren Aufgabe im Labor-Jargon
Restriktionsenzyme , Schnitte an bestimmten Stellen der DNA machen => verdauen
Welche Voraussetzung bezüglich der Enden von DNAs muss erfüllt sein, damit diese miteinander rekombiniert werden können?
sie müssen zusammenpassen
Wodurch kann DNA unspezifisch fragmentiert werden?
Durch Ultraschallbad
Restriktionsenzyme Funktion
- schneiden DNA an bestimmter Stelle (ausschließlich Doppelstrang DNA!) palindromisch => öffnen hierbei das Ribosephosphat-Rückgrat der DNA => Alle Bruchstrücke sehen dann gleich aus => verschiedene DNA-Moleküle (auch wenn sie aus verschiedenen
Organismen stammen!), die mit dem gleichen Restriktionsenzym geschnitten wurden, können wieder zusammengefügt – also rekombiniert – werden
siehe Bild: Einzelstrangbruch
DNA-Ligasen Funktion
verbinden DNA-Moleküle
Was versteht man unter einer Ligation?
Das Zusammenfügen zweier DNA-Fragmente (schließen einer Phosphodiesterbindung)
Vorteile und Nachteile von E. Coli als Klonier-Bakterium und als Wirtszelle zur Proteinherstellung
Vorteile:
• repliziert Plasmide natürlicherweise
• nicht pathogen, nicht mit Humanpathogenen infizierbar (z.B. viren)
• Genom komplett bekannt
• umfangreiche Erfahrung der Genetik
• nimmt leicht DNA auf
• schnelles Wachstum
• einfache Handhabung
• kostengünstige Medien
• Proteinproduktion leicht steuerbar
• hohe Proteinausbeuten
• einfaches Upscaling
• GRAS-Status (genetically recognized as safe): Wenn ein Organismus nicht auf dieser Liste ist, werden riesen Dossiers zur Zulassung benötigt, die die Sicherheit belegen
Nachteile:
• keine posttranslationalen Modifikationen
• Proteine oft nicht in der korrekten Tertiärstruktur
• Proteine oft denaturiert ("Inclusion bodies")
• Freisetzung von Pyrogenen => LPS aus Zellwand, gram -
• kaum Selektion von Proteinen
• Proteine, die N-Glykosilierungen oder andere posttranslationale Modifikationen für ihre Funktionalität benötigen können nicht in Bakterien hergestellt werden
Was ist ori?
origin of replication => Replikationsursprung, an dem die Zelle erkennt, dass es sich um eine replizierbare, aber extrachromosomale DNA handelt.
Wozu dienen Plasmide bei Bakterien?
zum horizontalen Gentransfer über Konjugation
Transformation von Bakterien
Methode, um fremde DNA in den Organismus zu bringen
andere Methode: mittels Elektroporation, erst 0°C, dann Feldstärke von 10-14 kV/cm anlegen mittels Kondensator => Strom durch die Zelle macht die Membran löchrig => Plasmidaufnahme => Ausbringen auf Selektionsagar
Auf dem Selektionsagar überleben nur die Zellen, die die Plasmide aufgenommen haben. Hierbei können sowohl leere Plasmide als auch solche mit der gewünschten rekombinierten DNA vorhanden
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Lernkarten
Was versteht man unter IPSC?
induced pluripotent stem cells
Vorgehensweise bei der Herstellung induzierter pluripotenter Stammzellen aus adulten Stammzellen
Mit welcher analytischen Methode bestimmt man die Reinheit von Proteinen?
Protein-Gelelektrophorese
Mit welchen analytischen Methoden bestimmt man die Identität von Proteinen?
immunbiochemische Methoden (z.B. Western-Blot)
Peptid-Fingerabdruck (MALDI-TOF-MS)
Proteinsequenzierung
Glykosylierungsmuster
Mit welchen analytischen Methoden kann man die biologische Aktivität eines Proteins bestimmen?
o Ligand-Bindungs-Tests
o zellbasierte Testsysteme
Stabilitätsanforderungen, denen ein AS während seiner gesamten Haltbarkeitsdauer genügen muss
• chemische Stabilität
o der Wirkstoff muss innerhalb der festgelegten Grenzen chemisch unversehrt und aktiv bleiben (kann zu kovalenten Modifikatinoen der Peptidstruktur, Oxidationen, Hydrolysen, Deamidierungen, Isomerisierungen und Disulfidumlagerungen kommen)
• physikalische Stabilität
o der Wirkstoff muss seine ursprünglichen Eigenschaften wie Aussehen, Gleichförmigkeit, Freisetzung und Suspendierfähigkeit unverändert erhalten ( Denaturierung, Aggregation, Assoziation, Präzipitation[Agggegate über 50μm, visuell sichtbar) und Oberflächenadsorption möglich)
• mikrobiologische Stabilität
o Sterilität bzw. Resistenz gegenüber Mikroben müssen über die gesamte Haltbarkeitsdauer den Spezifikationen entsprechen
o eventuell zugegebene Konservierungsmittel müssen innerhalb der festgelegten Parameter aktiv bleiben
• therapeutische Stabilität
o die therapeutische Wirksamkeit muss unverändert bleiben
• toxikologische Stabilität
o die Toxizität von Wirk- und Hilfsstoffen darf sich nicht verändern
Vorgehensweise bei der Findung einer optimalen Proteinformulierung
Vor- und Nachteile der Gefriertrocknung zur Trocknung von Proteinen. Wodurch werden Qualitätsverluste verursacht?
• Vorteile:
o Standard-Prozess
o im industriellen Maßstab gut durchführbar
o schonendste Methode zur Trocknung von Proteinen
o Hilfsstoffe und Prozessbedingungen sind so einstellbar, dass Aktivitätsverluste durch Einfrieren und Wasserentfernung vermieden werden
• Nachteile:
o zeitaufwendig (mehrere Tage)
o energieaufwendig (Entfernung von >>90% der Komponenten)
o teuer
o Batch-Prozess (begrenzte Chargengröße, Scale-up Probleme)
o begrenzte physikochemische Stabilität des Produktes (der amorphe Zustand muss erhalten werden)
o Lyophilisate reagieren hygroskopisch
• Qualitätsverlust durch
o inhomogenen Wärmetransfer
o Kollaps (Zusammenbruch)
o "Blow-out" des Lyophilisats
o Brechen der Vials durch Vakuum
o Brechen der Vials beim Verschleißen
o allmähliche Hydratisierung des Lyophilisats (undichte Vials)
Was sind Primärpackmittel von Proteinen für die Gefriertrocknung?
Vials (Durchstechflaschen)
Aufbau der Vials und benötigte Validierungen
• Aufbau:
o Gummistopfen
o Glasvial (Typ I Glas: Borosilicatglas)
o Bördelkappe (Originalitätsverschluss)
• Stopfen
o Lyo-Stopfen (Lyophilisat/Sublimationstrocknung- Stopfen: Butyl-, EPDM-, Naturgummi-, Nitril- und Silikonausführung)
o Liquid-Stopfen
o RTS = Ready-to-sterilize
o RTU = Ready-to-use
o Silikonisierung, Teflonisierung
• Validierungen, z.B.
o Extraktionsstudien
o Kompatibilitätsstudien
o Permeabilität/Dichtigkeit
Unter welchen Bedingungen werden die Vials für die Gefrietrocknung abgepackt?
Reinraum-Klasse A
Wann wird die Gefriertrocknung von Proteinen angewendet?
Wenn das Protein in flüssiger Formulierung nicht ausreichend stabil ist
Unter welchen Bedingungen werden die Vials geschlossen?
Nach Abschluss der Gefriertrocknung wird der evakuierte Innenraum des Gefriertrockners mit steriler Luft oder Stickstoff begast. Daraufhin werden die Vials unter partiellem Vakuum oder Atmosphärendruck verschlossen
Welche Wechselwirkungen sind am Stopfen möglich?
Was ist beim Eprex Zwischenfall geschehen?
Eprex, ein Epoetin-Präparat von Johnson & Johnson, ein Biosimilar, hat bei vielen Patienten Pure Red Cell Aplasia (PRCA), dauerhafte Blutarmut) verursacht.
Ursache: Herauslösen von Bestandteilen des Stopfens durch Polysorbat 80 nach Umstellen auf diesen Stabilisator
Gehaltsbestimmung von Proteinen erfolgt mittels...
HPLC
UV-Photometrie bei 280 nm
Welchen Grenzwert dürfen Biopharmazeutika-Präparate beim Bioburden-Test nicht überschreiten?
Bioburden-Test: Test auf lebensfähige Mikroorganismen
Grenze: max. 10 KBE/100mL
Stabilitätstests an Proteinen
• Thermischer Stress (Langzeitstabilität)
o ICH-Vorschriften:
o 4, 8, 13, 26, 39, 52, 78, 104, 130, 156 Wochen
o (-170°C, -70°C), -20°C, 2-8°C, 25°C/60%rh, 30°C/65%rh, 40°C/75%rh
• Mechanischer Stress
o Agitations-induzierte Denaturierung und Adsorption (durch Schütteln, Bewegung)
• Licht
• Sauerstoff
• Adsorption an Oberflächen
• Einfrieren/Auftauen
• Stabilität im Primerpackmittel
Was ist bei der i.v.-Applikation von Biopharmazeutika zu beachten bzgl. Lagerung, Lyophilisate und Anwendung?
o korrekte Lagerung der Arzneimittel durch geschultes Personal
o bei Lyophilisaten Notwendigkeit der aseptischen Vorbereitung in der Praxis bzw. Klinik
o nur beim Arzt möglich (ambulant, stationär)
o Nachbeobachtung durch den Arzt möglich
Was ist bei der s.c.-Applikation von Biopharmazeutika zu beachten bzgl. Lagerung und Anwendung?
o oft Eigenanwendung zu Hause möglich
o möglicherweise falsche Lagerung der
o Medikamente zu Hause (Beratung!)
o Beratung zur korrekten Anwendung
o häufig Schmerzen an der Einstichstelle
o keine Nachbeobachtung durch einen Arzt
Welche Applikationsart (i.v. oder s.c.) hat eine schlechtere Compliance?
s.c., weil es zuhause durch den Patienten selbst angewendet werden kann
Ab wann ist der Apotheker für eine korrekte Lagerung der Biopharmazeutika verantwortlich?
Ab Anlieferung
Was ist der Unterschied zwischen "kühl lagern und transportieren" und "im Kühlschrank lagern"?
Die Kennzeichnung „Kühl lagern und transportieren“ darf aber im zentralen Zulassungsverfahren nur ausnahmsweise verwendet werden, wenn das Arzneimittel unter keinen Umständen die vorgegebene Temperatur verlassen darf. Deshalb gilt für die meisten nur "im Kühlschrank lagern" auch wenn diese bei Transport kühl gehalten werden müssen, weshalb die Bezeichnung "Kühlkette" oft verwendet wird damit es nicht zu einer versehentlichen Lagerung bei Raumtemperatur kommt
Wodurch können Instabilitäten wie Adsorption und Aggregation bei der Applikation vermieden werden?
• Adsorption wird minimiert durch
o Minimierung der Grenzflächen
o Auswahl geeigneter Grenzflächen (Behältnisse, Stopfen, Schläuche,
Filtermaterialien)
o Stabilisierende Zusätze
• Aggregation wird minimiert durch Vermeidung von
o Schütteln
o Wärme
o Kontakt mit hydrophoben Grenzflächen
o Scherkräften
o Einfrier/Auftau-Zyklen (egal ob versehentlich oder absichtlich)
Mit was für einer Trägerlösung ist Trastuzumab inkompatibel?
5%-Glukose-Lösung
Für eine sachgerechte Applikation von Biopharmazeutika ist was zu beachten?
• die richtige Wahl der Trägerlösung, z.B. ist Trastuzumab inkompatibel mit 5% Glukoselösung; Aldesleukin ist inkompatibel mit 0,9% NaCl; manche Wirkstoffe reagieren sensibel auf den Zusatz von oberflächenaktiven
Substanzen (z.B. Polysorbat)
• Beachtung bekannter Kompatibilitäten mit PE-, PP- oder PVC-Behältnissen und des Applikationssystems (Schläuche)
• Vermeidung von Schaumbildung
• Benutzung von Inline-Filtern 5 µm mit geringem proteinbindenden Potenzial (z.B. Polyamid)
• ggf. Verwendung stabilisierender Zusätze (z.B. HSA)
• Reihenfolge der Zugabe beachten falls notwendig
• ggf. Lichtschutz
• Biologika niemals mit anderen Infusionslösungen mischen (es sei denn, die Kompatibilität des Proteinwirkstoffs mit der Infusionslösung wurde bestätigt)
Sind Biosimilars aus pharmazeutischer Sicht (laut Winkler zumindest) austauschbar mit dem Originalpräparat?
Nein, weil der Herstellprozess das Produkt definiert
Welche Krankheiten sind unter dem metabolischen Syndrom zusammengefasst?
abdominelle Adipositas führt zu
o Diabetes mellitus Typ 2
o Dyslipidämie
o Hypertonie
o Blutgerinnungsstörungen
Normbereich Glucosewerte im Blut
3-5,55 mmol/L => 0,5-1 g//L
Insulin: wichtigste Zielorgane und wichtigste Insulinwirkungen bzgl. Glukose, Fett und Aminosäuren
• wichtigste Zielorgane
o Muskeln (M)
o Fettgewebe (F)
o Leber (L)
wichtigste Insulinwirkungen:
o Glukose (fördert Abbau)
Förderung der Aufnahme von Glukose (M, F)
Stimulation der Glykogensynthese (M, F, L)
Hemmung der Glykogenolyse (M, F, L) und Glukoneogenese (L)
Stimulation der Glykolyse (M, F, L)
o Fett (fördert Aufbau)
Förderung der Lipogenese (F, L)
Hemmung der Lipolyse (F, L)
o Aminosäuren (fördert Aufbau)
Förderung der Aufnahme von Aminosäuren (M, F)
Förderung der Proteinsynthese (M, L)
Hemmung des Proteinabbaus (M, L)
Aussehen des Fettgewebes: braun vs. weiß
Funktion von abdominalem Fettgewebe
(Abdominales) Fettgewebe ist ein endokrines Organ, das Adipokine produziert
Adipokine Definition, Bsp.
Verbindungen, die vom Fettgewebe produziert und sezerniert werden und als Signalmoleküle wirken
Diabetes Mellitus Definition nach WHO
metabolische Erkankung multipler Genese, bei der durch Defekte in der Insulinsekretion, der Insulinwirkung oder einer Kombination beider Ursachen eine chronische Hyperglykämie mit Schädigungen im Kohlenhydrat-, Fett- und Proteinmetabolismus hervorgerufen wird. Er verursacht Langzeit-Schädigungen und Dysfunktionen verschiedener Organe
Diabetes Epidemiologie Deutschland
ca. 10% der Bevölkerung betroffen => 8 Mio.
Wo wird Insulin im Körper ausschließlich produziert?
in den β-Zellen der Langerhans-Inseln in der Pankreas
Wie ist der Aufbau des Insulin unterteilt?
es ist ein Präproprotein, wobei die Prä-Sequenz eine Signalsequenz darstellt und das Propeptid aus der A- und B-Kette und dem C-Peptid besteht.
Funktion des C-Peptids, wann abgespalten
Das C-Peptid zwingt das Insulin in eine Konformation, wo die Ausbildung der korrekten drei Disulfidbrücken optimiert ist. Es wird erst ganz zum Schluss, also kurz vor der Sekretion mittels spezifischen Proteasen entfernt
Woraus besteht das aktive Insulin?
A-Kette mit 21 AS und B-Kette mit 30 AS, die durch zwei Disulfidbrücken miteinander verbunden sind
Was dient in erster Linie als Signal für die Insulinfreisetzung?
Blutzuckeranstieg (meist nach dem Essen)
