Biopharmazeutika

1-2

- standardmäßig: >60

ansonsten: bei Grunderkrankungen, Schwangere ab dem 2. Trimenon, Menschen, die beruflich viel mit anderen Menschen in Kontakt stehen etc

o Morbus Basedow -> Schilddrüse
o Multiple Sklerose
o Myasthenia gravis
o Diabetes mellitus Typ I
o Psoriasis
o Rheumatoide Arthritis
o Morbus Bechterew
o Lupus erythematodes
o Sjögren-Syndrom I: Das Sjögren-Syndrom ist eine chronische Autoimmunerkrankung, die zu einer Entzündung der Speicheldrüsen bzw. serösen Drüsen des Kopf- und Halsbereiches führt.

Adalimumab

Etanercept

Tocilizumab

Rituximab

Infliximab

IgG

100% murin -> viele HAMAs

• eine Maus wird über mehrere Wochen mit 4-6 Dosen von 10-50 µg Protein immunisiert
• immunisierte Maus wird getötet
• Milz wird präpariert -> hat viele B-Zellen, die finden, die "unseren AK" exprimieren
• alle Lymphozyten werden aus dem retikulären Milzgewebe herausgelöst, mit dem Ziel, die B-Zellen zu gewinnen
• B-Zellen produzieren jeweils eine bestimmte Antikörperspezifität, können jedoch in Kultur nicht wachsen
• zunächst werden alle isolierten Milz-Lymphozyten mit murinen Myelomzellen (aus Krebs isoliert, unsterblich, ursprünglich B-Zellen) durch Zugabe von Polyethylenglycol fusioniert
• Selektion der entstandenen sog. Hybridomzellen (unsterbliche B-Zellen) in "HAT-Medium" (Mangelmedium aus Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin)
o Aminopterin: hemmt die Purinsynthese(hemmt die Umsetzung von PRPP zu IMP) und hemmt die Pyrimidin-Synthesed (TMP-Synthese, Umsetzung von dUMP zu dTMP) durch Folsäure-Antagonismus
o Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT) wandelt Hypoxanthin in IMP(Inositolmonophosphat) oder Guanin in GMP um -> ermöglicht Purin-Synthese über salvage-pathway
o Thymidinkinase (TK) wandelt Thymidin in dTMP(Desoxy-Thymidin-Monophosphat) um -> ermöglicht Pyrimidin-Synthese über Salvage-Pathway

=> Myelomzellen haben keine HGPRT, weshalb sie im HAT-Medium nicht wachsen können. B-Zellen haben zwar HGPRT, können aber in Kultur nicht wachsen, weshalb nur die Hybridomzellen überleben, welche sowohl durch die B-Zell-Komponente HGPRT positiv sind, als auch durch die Myelom-Komponente in Kultur wachsen können.

=> daraufhin erfolgt eine Selektion der Hybridomzellen, welche den AK zum gewünschten Antigen produzieren

-> Kultivierung der Hybridomzelle, die die gewünschte AK produzieren

-> Aufreinigung der AK

Salvage-Pathway ist allgemein die Bezeichnung für Stoffwechselwege, die die Synthese eines Biomoleküls aus seinen Abbauprodukten bewerkstelligen - eine Form des Recycling.

- Thymidin erlaubt den salvage-pathway für die Synthese der  Pyrimidine, welche durch Aminopterin eigentlich gehemmt wird

- Hypoxanthin erlaubt den salvage-pathway für die Purin Synthese, welche eigentlich ebenfalls durch Aminopterin gehemmt wird

• ELISA: Enzyme-linked immunosorbant assay
• Antigen wird an eine Plastik-Oberfläche gebunden
• ein Antikörper gegen dieses Antigen wird zugegeben; der Antikörper wird über die Bindung an das Antigen an die Plastik-Oberfläche fixiert; nicht gebundene Antikörper werden abgewaschen
• ein zweiter Antikörper wird zugegeben. Dieser Antikörper ist gegen den konstanten Fc-Teil des ersten Antikörpers gerichtet und mit einem Enzym gekoppelt, das durch Umsetzung eines Substrates eine Farbreaktion erzeugen kann.

Da ihr Maus-Anteil zu hoch ist werden viele HAMAs (human anti-mouse antibody) gebildet

• hochspezifische Moleküle gegen beliebige Ziele
• induzieren Komplement-abhängige Lyse (CDC; complement-dependent cytotoxicity)
• markieren Zellen für Lyse durch NKs (ADCC; antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), NK-Gabe allein wäre zu giftig, mit AK ists spezifisch
• können (maligne) Zielzellen mit Toxinen oder radioaktiven Tracern attackieren
• können zur passiven Immunisierung nach Exposition mit einem Pathogen eingesetzt werden -> zeitlich begrenzt, partiell

klinisch relevante Targets müssen extrazellulär bzw. auf der Zelloberfläche sein, da keine Membranpassierung erfolgt

• nur parenteral applizierbar
• schlechte Biodistribution -> bleiben lange in der Injektionsstelle, aber "Depot" -> werden über Lymphsystem aufgenommen und in den systemischen Kreislauf überführt
• hohe Clearance
• in der Tumortherapie Abfangen der Antikörper im Blut durch abgeschilfte zirkulierende Tumorzellen
• Auslösung von Immunreaktionen (Allergien) durch HAMAs (HAMA: Humane Anti-Maus-Antikörper) -> bei Maus-AK fast immer
• Auftreten neutralisierender Antikörper (ADA: Anti Drug-Antibodies) -> durch Humanisierung minimisierbar
• infusionsbedingte Nebenwirkungen
o Fieber
o Diaphorese (Fieber)
o Hypersensitivitätsreaktionen

Monoklonale Antikörper

• -mab: Monoklonaler Antikörper

Quellorganismus:

• u: Mensch
• o: Maus
• a: Ratte
• e: Hamster
• i: Primat
• zu: humanisiert
• xi: chimär
• axo: Ratte/Maus
• xizu: Kombination aus humanisierten und chimären Ketten

Krankheit/ Ziel:

• -vir- : viral
• -bac- : bakteriell
• -fung- :mykotisch
• -lim- : immunologisch
• -les- : infektiöse Läsion
• -cir- : kardiovaskulär
• -ner- : neurologisch
• -kin- : Interleukine 
• -mul- : Muskel-/Skelettsystem
• -os- : Knochen
• -toxa- : Toxin als Zielstruktur 

Tumor:

• -col- : Colon
• -mel- : Melanom
• -mar- : Mammakarzinom
• -got- : Hodenkrebs
• -gov- : Ovarialkarzinom
• -pr(o)- : Prostatakrebs
• -tum- : verschiedene Tumore

- Zunächst erfolgt die Herstellung eines spezifischen AK nach der Hybridoma-Technologie für das gewünschte Antigen. 

- Da für die Bindung an den Antikörper nur der variable Teil benötigt wird, kann der murine Konstante Teil durch einen humanen Fc-Teil ersetzt werden, damit eine weniger starke Immunreaktion ausgelöst wird.

- im nächsten Schritt werden die Gene für die  spezifischen, variablen, murinen Anteile mittels PCR isoliert -> mRNA aus Hybridomzelle, spezifische Primer für leichte Kette und Amplifikation dessen mittels RT-PCR????

- diese spezifischen murinen leichten Ketten werden dann in einem Plasmid vor die Gene für den humanen Fc-Teil eingefügt

- Transfektion in eine AK-Produzierende CHO Zelle -> Bildung chimärer Antikörper ???

Zur Herstellung "rein humaner" Antikörper

Prinzip: Isolierung von B-Zellen eines gesunden Spenders (ohne Immunisierung) -> mRNA von leichter und schwerer Kette in cDNA Umschreiben -> PCR mit unterschiedlichen Primern -> Klonierung in Phagemid Vektor -> Einschleusen in E.Coli -> Produktion der Phagen -> Präsentation des Antikörper-Fragmentes auf der Hülle des Virus (ganz viele unterschiedliche Phagen) -> durch Phagen-Panning Selektion für jeweiliges Antigen

• Klonierung von leichter und schwerer Kette in einen "Phagemid"-Vektor
• Transformation von E. Coli-Zellen
• Phagen entstehen durch Replikation des Phagemids; die Phagen können aus dem Kulturüberstand isoliert werden
• Die Phagen exprimieren ein "single chain FV" (scFv -> single chain variable Fragment: besteht aus variablen Teilen der schweren und leichten Ketten die mit einer Polypeptidbrücke verbunden sind) auf der Phagen-Oberfläche

Phagen Panning

Die Antigen-Spezifität wird in einem ELISA-ähnlichen Test bestimmt: Die Phagen werden an ein immobilisiertes Antigen gebunden. Dann werden ungebundene Phagen durch Waschen entfernt. Die am Antigen gebundenen Phagen können entweder durch einen Phagen-spezifischen Antikörper angefärbt werden oder man eluiert die Phagen von dem Antigen und nutzt sie zur Infektion von Bakterien mit dem Ziel, die antigenspezifischen Phagen zu vermehren.

monoklonale humane Antikörper

• Chronisch-entzündliche Darmerkrankung
• betroffen ist der gesamte Magen-Darm-Trakt
• diskontinuierlicher, segmentaler Befall des Darmepithels
• Prävalenz: 150 pro 100.000 Einwohner
• Inzidenz: 7-8 Neuerkrankungen pro 100.000 Einwohner
• Symptome: Schmerzen im rechten Unterbauch, Durchfall,
• Fieber, starker Gewichtsverlust, Übelkeit, Erbrechen
• flukuierender Verlauf (schubweise)
• Therapie:
o Salfasalazin, Mesalazin
o Glucocorticoide (Budesonid)
o Immunsuppressiva (Azathioprin,
o Methotrexat, Ciclosporin)
o Biopharmazeutika

• Chronisch-entzündliche Darmerkrankung
• betroffen vor allem Mast- und Enddarm
• Entzündung beschränkt sich auf die Darmschleimhaut (Mukosa und Submukosa)
• Prävalenz: 200 pro 100.000 Einwohner
• Inzidenz: 3-4 Neuerkrankungen pro 100.000 Einwohner
• Symptome: rezidivierende Diarrhoen, Darmblutungen, Koliken
• flukuierender Verlauf (schubweise)
• Therapie:
o Mesalazin (5-Aminosalicylsäure)
o E. coli Nissle-1917 (Mutaflor®)
o Glucocorticoide (Budesonid)
o Immunsuppressiva (Azathioprin, Methotrexat,
o Ciclosporin)
o Biopharmazeutika

• Chronisch entzündliche Hauterkrankung
• bei 2-5% der deutschen Bevölkerung (> 1,6 Mio Patienten)
• multifaktorielle Erbkrankheit, maßgeblich von Umwelteinflüssen beeinflusst
• Beginn oft im jungen Erwachsenenalter
• Krankheitsverlauf wechselhaft und in Schüben
• entzündliche Vorgänge (insbesondere übermäßige Aktivierung von T-Lymphozyten)
• T-Zellen regen Keratinozyten zu übermäßiger Proliferation an

Symptome: Psoriasisflechte (siehe Bild etc.)
• Therapie:
o Dithranol: Anthracenon-Derivat, wirkt oxidativ -> bildet ROS, unbedingt Hände waschen, da sonst Schmerzen! Und Bleichen der Kleidung
o Cortisol
o Vitamin D (topisch angewendet: Mittel der ersten Wahl bei leichter- mittelschwerer Psoriasis ist Calcitriol (Beispiel: Silkis®), ist die eigentliche Wirkform von Vitamin D3 (Colecalciferol) und bindet als Steroidhormon an einen nukleären Vitamin D3-Rezeptor (VDR), der wie die Thyroid- und Retinoid-Rezeptoren zur Superfamilie der Steroidhormon-Rezeptoren gehört. Über die Hormonwirkung erklären sich die ausgeprägten proliferationshemmenden und differenzierungsfördernden Eigenschaften auf Keratinozyten. Seiner Hauptaufgabe entsprechend beeinflusst Calcitriol die Calciumresorption und -mobilisation. Daher kommt es für die systemische Therapie nicht in Frage.)
o schwere Formen:
Immunsuppressiva (Methotrexat, Ciclosporin)
Biologicals

• systemische Autoimmunerkrankung
• charakteristisch: Schmetterlingserythem (siehe Bild)
• oft systemisch mit Symptomen wie Fieber, Abgeschlagenheit, Empfindlichkeit gegen Sonnenlicht, rheumatoide Beschwerden
• engl.: systemic Lupus erythematosus (SLE)
• Typ-III-Überempfindlichkeitsreaktion
• Ursache unbekannt (➜ Kollagenosen)
• verläuft meist schubförmig
• Prävalenz ca. 40 pro 100.000
• Autoantikörper insbesondere gegen nukleäre Antigene (ssDNA, dsDNA, Histone)
• Titer an Anti-dsDNA-Autoantikörpern als diagnostischer Parameter

Therapie: Biologicals

• Synonym: Spondylitis ankylosans
• chronisch-entzündliche Wirbelsäulenerkrankung
• betrifft ca. 0,3% der Bevölkerung
• betroffen zu 80-90% sind Männer im 3. Lebensjahrzehnt
• vor allem befallen: Iliosakralgelenke und Wirbelbogengelenke
• betrifft auch Sehnen und Sehnenansätze (Tendenz zu Enthesiopathien)
• allmähliche Versteifung

Therapie: Biologicals

• Synonym: Chronische Polyarthritis
• chronische, progrediente Systemerkrankung des Bindegewebes
• progressive Gelenkzerstörung
• Befall vor allem der kleinen peripheren Gelenke
• Autoimmunkrankheit
• fluktuierender klinischer Verlauf
• unvorhersehbare Prognose
• i.d.R. Verkürzung der Lebensspanne um 5-10 Jahre
• betroffen ca. 1% der Bevölkerung, in Deutschland ca. 800.000 Patienten
• Erkrankung verläuft schubweise
• in 50-70% der Fälle extravertebrale Arthritiden
• generelle Morgensteifigkeit
• starke genetische Komponente (HLA-B27)

Schematische Darstellung eines normalen Gelenks (links) und seiner Veränderungen bei RA (rechts). Unter physiologischen Bedingungen (links) ist die Synovialmembran <100 µM dick und setzt sich aus einer dünnen Schicht (1-3 Zellen) von Synoviozyten zusammen. Mit Ausnahme des Knorpels bedeckt die Synovialmembran alle intraartikulären Strukturen. Bei der Rheumatoiden Arthritis (rechts) kommt es zu einer Entzündung der Synovialmembran (Synovitis), die von einem transendothelialen Influx und/oder einer lokalen Aktivierung verschiedener Zellen (T-Zellen, B Zellen, Plasmazellen, Dendritische Zellen, Makrophagen, Mastzellen) sowie einer Gefäßneubildung vermittelt wird. Die synoviale Zellschicht hyperplasiert (Dicke >20 Zellen), die Synovialmembran erweitert sich und bildet Zotten. Der destruktive Anteil der Synovialmembran wird als Pannus bezeichnet. In Folge der Freisetzung von Zytokinen
(vor allem TNFα und IL-1) kommt es zum proteolytischen Knorpelabbau durch Synoviozyten und Chondrozyten sowie zur Knochen-Zerstörung durch Osteoklasten.

Therapie: 

- MTX

- Biologicals

...

• durch unbekannte Noxen werden im Bereich der Synovialmembran, die reich an Nerven und Blutgefäßen sind, Selbstantigene durch APCs präsentiert.
• es wird eine Entzündung ausgelöst, die scheinbar vornehmlich durch TH₁-Zellen induziert wird. Sie sezernieren nach Aktivierung vor allem IL-2 und IFNγ
• dadurch werden Makrophagen zur Freisetzung von IL-1 und TNFα angeregt
• B-Zellen werden aktiviert und proliferieren und produzieren IgG-Antikörper
• aufgrund unbekannter Umstände (lokale Zytokin-Zusammensetzung?) werden von anderen B-Zellen IgM-Antikörper (sog. Rheumafaktoren) gebildet, die gegen den Fc-Teil der IgG-Antikörper gerichtet sind.
• diese IgM-Antikörper binden das Selbstantigen und bilden zusammen mit IgG- Antigen-Komplexen und Komplement-Komponenten größere Immunkomplexe, die von Makrophagen phagozytiert werden (was diese wiederum anregt, noch mehr IL- 1 und TNFα zu bilden)
• proinflammotrorische Zytokine wie IL-1, IL-2 und TNFα induzieren die Bildung weiterer proinflammatorischer Substanzen (Prostanglandine, ICAMs E-Selektine etc) und manifestieren damit eine chronische Entzündung
• IL-1 und TNFα aktivieren Chondrozyten und Fibroblasten zur Bildung von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), die Kollagen proteolytisch abbauen und damit eine lokale Zerstörung von Knorpel und Knochen einleiten
• die IL-1-vermittelte Ausschüttung des Zytokins RANK-Ligand (Ligand des receptor activator of nuclear factor κB) aktivert Osteoklasten und verstärkt den Knochenabbau.

Symptom-modifying antirheumatic drugs, Akuttherapeutika bei RA

Therapie der Symptome: Schmerzen, Schwellungen, Entzündung)

Glucocorticoide
NSAIDs (Nicht-steroidal anti-inflammatory drugs)

Disease-modifying antirheumatic drugs; Basistherapeutika bei RA -> Hemmung der Krankheitsprogression

Methotrexat
Leflunomid
Goldverbindungen (Natriumaurothiomalat)
Chloroquin, Hydroxychloroquin
Sulfasalazin
Ciclosporin
Azathioprin
Biologicals ("Anti-Zytokine")

• sezerniert als 26 kDa-membranständiges Protein
• wird extrazellulär durch TACE (TNFα converting enzyme) zu einer löslichen 17 kDa-Form umgewandelt
• TNFα bildet ein Homotrimer
• es gibt zwei TNFα-Rezeptor (TNFR)-Moleküle, die 55 bzw. 75 kDa groß sind; die Rezeptoren können auch als lösliche Rezeptoren von der Zelle "abgeschält" werden und können löslichen TNFα binden und neutralisieren
• ein TNFα-Monomer bindet zwar an seinen Rezeptor, kann aber keinen biologischen Effekt auslösen, weil dazu eine Trimerisierung des Rezeptors nötig ist; also muss TNFα als Trimer binden, um drei TNFR-Moleküle zu vernetzen.

o LPS-aktivierte Makrophagen
o aktivierte T-Zellen
o aktivierte NK-Zellen
o aktivierte Mastzelle

physiologische und pathophysiologische Effekte von TNFα sind stark mit der Konzentration des Zytokins verbunden:
o bei physiologischen Konzentrationen im Bereich 10^-9 M wirkt TNFα vor allem als lokaler autokriner und parakriner Faktor auf Leukozyten und Endothelzellen und bewirkt u.a.
verstärkte Adhäsion von Leukozyten ans Endothel
Aktivierung anderer Immunzellen, darunter Neutrophile, Eosinophile und Monozyten
verstärkte Synthese und Freisetzung anderer Zytokine, darunter IL-1, IL-6, IL-8, und TNFα selbst
Aktivierung von T-Zellen und Stimulation der Antikörper-produktion in Plasmazellen, allerdings indirekt über IL-1 und IL-6