BATL

Gesamt-Akt._TOP = 9,5 U/mL x 5,8 mL = 55,1 U

Gesamt-Akt._Homog = 16 U/mL x (5 g/ 1,1 g/L) = 72,7 U

=> Ausbeute = (55,1 U x 100%)/72,7 U = 75,8%

spez. Akt._Homog = 0,35 U/mg

spez. Akt._TOP = 9,5 U/mL / 3,6 mg/mL = 2,6 U/mg

=> Aufreinigungsfaktor = 2,6 U/mg / 0,35 U/mg = 7,4-fache

60% TOP I

7% KPO₄, pH 7,0

1% g NaCl

32% g deion. Wasser

Das abzutrennende Protein in die TOP zu überführen während alle anderen Zellbestandteile sich in der BOT anreichern. => Zelltrümmerabtrennung

wässriges 2-Phasen-Gemisch

Steigkanal

radial angeordnete Rippen

Separierungsraum

Abflus leichte und schwere Phase

• verwendung einer größeren Düse
• versetzen der Steigkanäle weiter nach Außen

variieren:

• des Volumenstroms
• der Düsenlänge
• der Drehzahl
• des Abstandes der Teller zueinander
• der Lage der Steigkanäle

Durch die Drehung des Tellerseperators wird die BOT-Phase nach Außen gedrückt und die TOP-Phase nach Innen. Die eigentliche Auftrennung erfolgt auf den Tellerstufen, hier steigen beide Phasen durch die Steigkanäle nach oben. Dort verteilen sich die Phasen dann entsprechend nach Innen oder Außen entlang der Teller. Durch getrennte Ausgänge erhält man eine TOP und eine BOT-Phase. Vorraussetzung für die Trennung ist der richtige Staudruck und die position der Steiglöcher (abhängig von der Zusammensetztung des Homogenats).

In der Fumarase-Fraktion befinden sich auch alle anderen Proteine, die nicht von der Säule gebunden wurden, während in der Gl-6-P-DH-Fraktion nach möglichkeit nur das Enzym vorliegt. Damit ist das gebundene Enzym reiner als das Enzym das nicht an der Säule gebunden wurde.

Flux = Volumenstrom pro Fläsche [m³/Lxh]

=> Diafiltration

lineare Flussrate = Volumenstrom pro Querschnittsfläsche der Säule [cm/h]

=> Chromatographie

Eluationsvolumen = von Anfang des Volumens bis zum erreichen der Peakmitte -> V od. t gegen OD aufgetragen

=> Chromatographie

Verteilungskoeffizient K = U/mL TOP pro U/mL BOT

=> 2-Phasensystem

Aufreinigungsfaktor = spez. Akt. _Ist pro spez. Akt. _Homogenat

=> Enzymaktivitätsbestimmung z.B. einer Fraktion aus einer Chromatographie

0,5 L

Der Anteil an KH₂PO₄ muss erhöht werden, da der pH abgesenkt werden soll. Denn KH₂PO₄ ist der saure Anteil im Puffer, während K₂HPO₄ der basische Anteil im Puffer ist.

Hefezellen tragen eine negative Oberfläschenladung, die von der Dissoziation der Carboxylgruppen der Zellwandproteine bei physiologischen pH-Wert herrühren. Wird Kalkmilch (Ca²) als Flockungsmittel eingesetzt, so wird die negative Ladung der Zellen neutralisiert. Bei einer bestimmten Ca²-Konzentration, stoßen die Zellen, die nunmehr ihre negative Ladung verloren haben, sich nicht mehr ab. Sie treten mit benachbarten Zellen in Kontakt (Agglomerate) und sedimentieren.

Gesetz: Stok´sche Gesetz

Ist die Ca²-Konzentration zu hoch, so überziehen sich die Hefezellen mit einer positiven Ladung und stoßen sich somit wieder ab. Die Agglomerate lösen sich wieder auf und erzeugen wieder eine Trübung im Überstand.

Ca²-Ionen bilden zusätzlich Hydrokoloide, also selbst diskrete Teilchen, so sedimentieren diese Agglomerate und reißen dabei Zellen aus der Umgebung mit. Durch diesen Einfluss wird die Sedimentationsgeschwindigkeit der Hefezellen erhöht. Hydrokolloide werden durch Neutralisation der CaCl₂-Lösung, in unseren Fall durch die Zugabe von KPi-Puffer hergestellt. Die mehr oder weniger klare CaCl₂-Lösung wird durch Ausflocken der Hydrokolloide trüb.

BSA-Konzentration [µg/100 µL] gegen Extinktion bei 595 nm

Alterung des Bradford-Reagenzes bedingt Zunahme des Blindwertes, durch Erhöhung der Eigenextinktion.

-> tägliches filtrieren + Eichkurve erstellen um Fehler zu kompensieren

Es wird gegen Wasser abgeglichen und es besitzt eine Eigenextinktion von ca. 0,28 Absorptionseinheiten.

(µg/100 µL x Faktor x Verdünnung)/1000 = [mg/mL]

Eichkurve = Standard-Konzentration gegen Extinktion  [µg/100 µL]

Faktor = Umrechnung 100 µL in 1 mL

1000 = Umrechnung µg in mg

Verdünnung 1:50 = 50

Bindung des Farbstoffes ans Protein durch ionische und hydrophobe WW.

Folge: Verschiebung des Absorptionsmaximum von 465 nm nach 595 nm.

Malat + Fumarase -> Fumarat + Wasser

L-Malat + Dikaliumphosphat-Lösung

250 nm

(Gesamtvolumen [mL] x Verdünnung)/(e [cm²/µmol] x enzym [mL] x d [cm]) x deltaE [L/min] = [U/mL]

NaCl zerfällt in wässriger Lösung in die einzelnen Ionen Na+ u. Cl-, die an neg. u. pos. geladenen Regionen des Enzyms binden.

Mit anlagern der großen Hydrathülle um Löslichkeit in salzhaltigen Phase zu optimieren.

Amoniumsulfatfällung

Ladung und Ionen bewirken Ausbildung der Tertiärstruktur + WW mit dem umgebenden Lösungsmittel

-> Zugabe von Salz bewirkt eine Konkurrenz zwischen dem durch das Salzion gebundenes Wasser und der Hydrathülle um das Protein

-> somit können Proteine zwischen unterschiedlichen Molekülen direkt interagieren -> Präzipitation

über N (Passagen) = (Volumenstrom/Ausgangsvolumen) x t

ln (Rm/ Rm-R) = k x N

Auftragung ln (Rm/Rm-R) gegen N -> Steigung = k

Rm = max Aufschlussgrad (100%)

R = Ist-Aufschlussgrad

Temperatur regelbar

Aufschluss aller Mikrorganismen

Abrieb der Mahlkugeln

kleine Zelltrümmer

große Zelltrümmer

Luft führt zur Umwucht

Grobpartikel müssen vorher abgesiebt werden

Nimmt die Drehzahl ab so wird auch k kleiner.

Der Zellaufschluss erfolgt durch die Übertragung von Bewegungsenergie über Adhäsionskräften in Verbindung mit Verdrängungskräften, die zurückzuführen sind auf die Anordnung und Ausführung der Rührerscheiben, übertragen.