Bakteriengenetik Teil 7
Transcription basics
Transcription basics
Welche Komponenten hat die Bakterielle RNA Polymerase?
d
Beschreiben Sie den bakteriellen Transkriptionsvorgang.
- Template Erkennung
- Polymerase erkennt Promoterbindestelle
- Entstehung der „transcription bubble“
- Aufschmelzen der DNA durch Bending des Stranges um Polymerase
- Initiation der Transkription
- Erste RNA-Nukleotide werden an das Template gebunden
- σ-Faktor löst sich von dem Initiationskomplex
- Elongation
- Syntheserichtung: 5‘à 3‘
- An dem 3‘ Ende wird immer ein aktiviertes Triphosphatribonukleotid unter Hydrolyse von 2 Pyrophosphat angehängt
- Während mRNA synthetisiert wird beginnt direkt die Translation
- Termination
- Ausbildung eines Hairpins und poly-U
Nennen Sie zwei fundamentale Unterschiede zwischen prokaryoter und eukaryoter Genexpression.
- Eukaryoten besitzen 3 verschiedene RNA-Polymerasen, die verschiedene Genkategorien transkribieren
- RNA-Polymerase I: ribosomale RNA
- RNA-Polymerase II: transkribiert die meisten Gene
- RNA-Polymerase III: tRNA, 5S rRNA, small RNA molecules
- Trnaskriptionsfaktoren in Eukaryoten (spezifische und allgemeine) z.B. TFI/II/III für RNA-Polymerasen
- Transkription im Kern, ausschleusen der mRNA. Translation im Cytoplasma ↔ Prokaryoten: Anlagerung direkt an Ringchromosom und gelichzeitige Translation
- Eukaryotische mRNA wird noch prozessiert à Splicen der Introns, zusammenfügen der Exons
Wie wird die bakterielle Transkription terminiert?
- Intrinsische/ρ-unabhängige Termination
- Entstehung eines Hairpins am Ende der mRNA durch komplementäre Basenpaarung (G-C-reich am Stamm)
- Poly-U sorgt für schwache Wechselwirkung der Basenpaare
- Polymerase und mRNA fallen von der DNA ab (hairpin sterische Hinderung)
- Terminationseffizienz: 2-90%
- ρ-abhängige Termination
- ρ –Faktor (ringförmiger Komplex) bindet an mRNA (C-reich, G-arme Sequenz)
- bindet an 5‘-Ende der mRNA und beginnt die mRNA aktiv aufzuwickeln unter ATP-Verbrauch. Kommt es zum direkten Kontakt der Polymerase mit dem ρ -Faktor, so fällt die Polymerase ab
- Terminationseffizienz ~ 100 %
Die Gleichgewichtskonstante der Bindung der RNA Polymerase an einen bakteriellen Promoter beträgt etwa K = 2 x 107 M-1. In Gegenwart des Repressors beträgt sie etwa 109 M-1. Was könnte die biologische Funktion des Unterschiedes sein?
Die Affinität der RNA-Polymerase an Promotor wird bei Anwesenheit des Repressors erhöht. Da der Repressor meist in der Nähe des Promotors bindet, weißt der Repressor der RNA-Polymerase sozusagen den Weg, wo später etwas abzulösen ist. Auf diese Weise ist es möglich, dass eine Zelle schnell umstellen kann von einem repressiven Zustand in einen exprimierenden Zustand. Sollte sich der Repressor lösen, so wird das Gen direkt abgelesen. à Bevorrangung der RNA-Polymerase bei Repressor + Promotor
Nennen Sie die Strukturelemente eines bakteriellen Promoters und ihre Funktion.
3 consensus-Pattern
- -35: σ-Faktor-Bindestelle TTGACA
- -10: σ-Faktor-Bindestelle TATAA
- Dazwischen variable Regionen
- +1: 1. Nukleotid der RNA
Wie kann man Länge und Konzentration einer mRNA bestimmen? Was sind die Vorteile und Nachteile der Methoden?
- RT-PCR (reverse trancripted PCR)
- Q-PCR: quantitativ, Bestimmung der Menge der mRNA bis zu gewissem Grad möglich
- Northern Blot:
- RNA „notorisch“ instabil à hohe Verunreinigungen bei Nachweis
- Gelauftrennung: Marker, spezielle Puffer
- Bestimmung der Länge der RNA und des Titers der mRNA, auch Aussage über Länge der Operons möglich
- Next generation Sequencing à Bestimmung des Transkriptoms
- Array-Technologie
- Bestimmung des gesamten Transkriptoms
- aber: sehr kompliziert und schlechte Ergebnisse möglich
- Promotor-Analyse/Promotor-Screening:
- Transformation von DNA-Fragmenten (mit Restiktionsenzym geschnitten) in geschnittenes Plasmid mit Reportergen à bei Promotoraktivität des geschnittenen Chromosoms: Expression
- NUR für bakterielle Promotoren, Promotoren könnten zerschnitten werden, evtl. Umweltsignale zur Aktivierung nötig
Wie bestimmt man den +1 der Transkription?
- Anlagerung des Primers der Reversen Transkriptase an mRNA
- Elongation des Primers zum 5‘-Ende der mRNA (UMGEKEHRT! à Ende neuer Primerverlängerung = Anfang der Translation!) à Primer-Extension bis +1
- Sanger-Sequenzierung à Identifizierung der +1-Base
nicht ganz richtig, man lagert noch einen zweiten Primer an, der die gleiche Sequenz wie der andere Primer hat, führt aber eine Replikation durch. Dadurch hat man ein Stück DNA, dass die gleiche Länge wie das mit der RT hat. (ungefähr)
Erklären Sie, wie man durch ein DNA footprinting Experiment die Bindungsstelle der RNA Polymerase an den Promoter herausfinden kann.
- DNA wird an einer Seite mit Fluoreszenz markiert
- In-Vitro-Bindung der Polymerase
- Zugabe von Endonukleasen, die die DNA dort zerschneidet, wo sich die Polymerase nicht befindet
- Zufällige Bruchstücke entstehen, bis auf RNA-Polymerase-Bindestelle (besetzt durch RPo und somit kein Schnitt möglich)
- Gelelektrophorese nach Größe der Fragmente
- Missing bands im RPo-Bindestellenbereich
- Durch Vergleich der Längen ist feststellbar, wo genau die Polymerase gebunden hat
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Welche Komponenten hat die Bakterielle RNA Polymerase?
d
Beschreiben Sie den bakteriellen Transkriptionsvorgang.
- Template Erkennung
- Polymerase erkennt Promoterbindestelle
- Entstehung der „transcription bubble“
- Aufschmelzen der DNA durch Bending des Stranges um Polymerase
- Initiation der Transkription
- Erste RNA-Nukleotide werden an das Template gebunden
- σ-Faktor löst sich von dem Initiationskomplex
- Elongation
- Syntheserichtung: 5‘à 3‘
- An dem 3‘ Ende wird immer ein aktiviertes Triphosphatribonukleotid unter Hydrolyse von 2 Pyrophosphat angehängt
- Während mRNA synthetisiert wird beginnt direkt die Translation
- Termination
- Ausbildung eines Hairpins und poly-U
Nennen Sie zwei fundamentale Unterschiede zwischen prokaryoter und eukaryoter Genexpression.
- Eukaryoten besitzen 3 verschiedene RNA-Polymerasen, die verschiedene Genkategorien transkribieren
- RNA-Polymerase I: ribosomale RNA
- RNA-Polymerase II: transkribiert die meisten Gene
- RNA-Polymerase III: tRNA, 5S rRNA, small RNA molecules
- Trnaskriptionsfaktoren in Eukaryoten (spezifische und allgemeine) z.B. TFI/II/III für RNA-Polymerasen
- Transkription im Kern, ausschleusen der mRNA. Translation im Cytoplasma ↔ Prokaryoten: Anlagerung direkt an Ringchromosom und gelichzeitige Translation
- Eukaryotische mRNA wird noch prozessiert à Splicen der Introns, zusammenfügen der Exons
Wie wird die bakterielle Transkription terminiert?
- Intrinsische/ρ-unabhängige Termination
- Entstehung eines Hairpins am Ende der mRNA durch komplementäre Basenpaarung (G-C-reich am Stamm)
- Poly-U sorgt für schwache Wechselwirkung der Basenpaare
- Polymerase und mRNA fallen von der DNA ab (hairpin sterische Hinderung)
- Terminationseffizienz: 2-90%
- ρ-abhängige Termination
- ρ –Faktor (ringförmiger Komplex) bindet an mRNA (C-reich, G-arme Sequenz)
- bindet an 5‘-Ende der mRNA und beginnt die mRNA aktiv aufzuwickeln unter ATP-Verbrauch. Kommt es zum direkten Kontakt der Polymerase mit dem ρ -Faktor, so fällt die Polymerase ab
- Terminationseffizienz ~ 100 %
Die Gleichgewichtskonstante der Bindung der RNA Polymerase an einen bakteriellen Promoter beträgt etwa K = 2 x 107 M-1. In Gegenwart des Repressors beträgt sie etwa 109 M-1. Was könnte die biologische Funktion des Unterschiedes sein?
Die Affinität der RNA-Polymerase an Promotor wird bei Anwesenheit des Repressors erhöht. Da der Repressor meist in der Nähe des Promotors bindet, weißt der Repressor der RNA-Polymerase sozusagen den Weg, wo später etwas abzulösen ist. Auf diese Weise ist es möglich, dass eine Zelle schnell umstellen kann von einem repressiven Zustand in einen exprimierenden Zustand. Sollte sich der Repressor lösen, so wird das Gen direkt abgelesen. à Bevorrangung der RNA-Polymerase bei Repressor + Promotor
Nennen Sie die Strukturelemente eines bakteriellen Promoters und ihre Funktion.
3 consensus-Pattern
- -35: σ-Faktor-Bindestelle TTGACA
- -10: σ-Faktor-Bindestelle TATAA
- Dazwischen variable Regionen
- +1: 1. Nukleotid der RNA
Wie kann man Länge und Konzentration einer mRNA bestimmen? Was sind die Vorteile und Nachteile der Methoden?
- RT-PCR (reverse trancripted PCR)
- Q-PCR: quantitativ, Bestimmung der Menge der mRNA bis zu gewissem Grad möglich
- Northern Blot:
- RNA „notorisch“ instabil à hohe Verunreinigungen bei Nachweis
- Gelauftrennung: Marker, spezielle Puffer
- Bestimmung der Länge der RNA und des Titers der mRNA, auch Aussage über Länge der Operons möglich
- Next generation Sequencing à Bestimmung des Transkriptoms
- Array-Technologie
- Bestimmung des gesamten Transkriptoms
- aber: sehr kompliziert und schlechte Ergebnisse möglich
- Promotor-Analyse/Promotor-Screening:
- Transformation von DNA-Fragmenten (mit Restiktionsenzym geschnitten) in geschnittenes Plasmid mit Reportergen à bei Promotoraktivität des geschnittenen Chromosoms: Expression
- NUR für bakterielle Promotoren, Promotoren könnten zerschnitten werden, evtl. Umweltsignale zur Aktivierung nötig
Wie bestimmt man den +1 der Transkription?
- Anlagerung des Primers der Reversen Transkriptase an mRNA
- Elongation des Primers zum 5‘-Ende der mRNA (UMGEKEHRT! à Ende neuer Primerverlängerung = Anfang der Translation!) à Primer-Extension bis +1
- Sanger-Sequenzierung à Identifizierung der +1-Base
nicht ganz richtig, man lagert noch einen zweiten Primer an, der die gleiche Sequenz wie der andere Primer hat, führt aber eine Replikation durch. Dadurch hat man ein Stück DNA, dass die gleiche Länge wie das mit der RT hat. (ungefähr)
Erklären Sie, wie man durch ein DNA footprinting Experiment die Bindungsstelle der RNA Polymerase an den Promoter herausfinden kann.
- DNA wird an einer Seite mit Fluoreszenz markiert
- In-Vitro-Bindung der Polymerase
- Zugabe von Endonukleasen, die die DNA dort zerschneidet, wo sich die Polymerase nicht befindet
- Zufällige Bruchstücke entstehen, bis auf RNA-Polymerase-Bindestelle (besetzt durch RPo und somit kein Schnitt möglich)
- Gelelektrophorese nach Größe der Fragmente
- Missing bands im RPo-Bindestellenbereich
- Durch Vergleich der Längen ist feststellbar, wo genau die Polymerase gebunden hat
