Bakteriengenetik Teil 2

1. eine Phage infiziert eine einzelne Zelle in enem Bakterienrasen
2. Phage reproduziert sich in der Zelle, etwa 50 Phagen pro infizierter Zelle
3. Lyse der Zelle entlässt Phagen in Medium, Phagen diffudieren in angrenzende Zellen
4. usw.

d

1. Injection der Phagen-DNA 
   1. 0min
2. Synthese von früher mRNA und Proteinen
   1. 5min
3. DNA-Replikation
   1. 15min
4. Synthese von später mRNA + Proteinen
   1. 20min
5. Verpacken der DNA in Köpfe
   1. 30min
6. Lyse und Phagenfreisetzung
   1. 40min

• Lysogeny wird von einem autogenen Kreislauf aufrecht erhalten
• wird dieser Kreislauf unterbrochen, startet der lytische Zyklus

d

Wettkampf entscheidet, ob die Phage den lytischen oder den lysogenen Zyklus beschreitet

A) Schlüssel Gene und Sites sind gezeigt

B) Genexpression früh nach der Infektion

C) Fülle von aktiven CII Proteinen entscheidet, ob die PHage lytisch oder lysogen wird

D) Synthese von Cro ist Promotor für lytische Entwicklung indem die Synthese von CI Repressor unterdrückt wird, SObald O und P synthetisiert sind, schwächt die Replikation der Lambda-DNA den CI Repressor

E) Synthese von CII startet Lysogeny

• CIII ist Inhibitor der Metalloprotease um die degradierung zu CII zu verhindern
• Hohe Konzentrationen an CIII -> Stabilisation von CII -> Lysogenisierung
• Translation von cIII Transkript wird über alternative RNA Strukturen reguliert

Phagentherapie bietet sich vor allem bei Bakterien an, die Resistenzen gegen Antibiotika 
aufweisen. Die Bakterien könnten aufgrund der Spezifität der Phagen in der Wahl ihrer 
Wirte gezielt bekämpft werden, während eukaryotische Zellen von den Phagen nicht 
geschädigt werden. Die Viren würden nur die Zellen angreifen, die die Targetmoleküle 
des Phagen auf der Oberfläche tragen. So wäre es zum Beispiel denkbar, male-spezifische 
Phagen die an das Pilin-Protein des Sexpilus binden zu verwenden.  

Die Nachteile sind, dass Phagen unter Umständen auch die in Symbiose mit den 
Menschen lebenden Bakterien befallen können. Dadurch ergeben sich zahlreiche weitere 
Probleme vor allem im Darm, da sich dort dann aufgrund des Fehlens der vorteilhaften 
Bakterienflora schädliche Bakterien ansiedeln könnten, die nicht von den Phagen befallen 
werden. Des weiteren können die Phagen selbst als Antigene wirken und vom 
Immunsystem attackiert werden, sodass sie nach einigen Behandlungen eine 
Immunreaktion auslösen anstatt die Bakterien zu bekämpfen, wie es gedacht war.

Phagen stellen zum Beispiel einen alternativen Klonierungsvektor dar. Statt mit Plasmiden 
kann auch mit Phagen ein Fremd-DNA-Fragment in eine Bakterienzelle eingebracht 
werden. Bei der generellen Transduktion kann zum Beispiel ein zufälliges DNA-Fragment 
der Wirtszelle statt der Phagen-DNA in einen Phagenkopf verpackt werden. Wenn dieser 
Phage dann die nächste Zelle infiziert, kann das injizierte DNA-Fragment über 
Rekombination an einer zufälligen Stelle in das Wirtsgenom aufgenommen werden. 
Dadurch können zum Beispiel Plasmide, Transposons oder Genomfragmente (zwischen 
verwandten Bakterien) übertragen werden. Die Rekombination bei der Übertragung von 
Genomfragmenten ist für gewöhnlich nur möglich, wenn das übertragene Fragment 
extensive Sequenzhomologie zu einem Fragment des Rezipientenstamms aufweist.  
Generelle Transduktion wird zum Beispiel genutzt, um bestimmte Allele in verschiedene 
Bakterienstämme einzubringen oder um isogene Stämme zu erzeugen, die sich nur in 
einer sehr kleinen Region unterscheiden. Somit wird Transduktion genutzt für die 
Konstruktion neuer Bakterienstämme oder um Knockouts für die funktionelle Genomik zu 
erzeugen.  
Durch die Verwendung von Phasmiden (= Mischung aus Plasmid und Phagen) kann auch 
DNA in Bakterien transferiert werden, für die es sonst kein Transfersystem gibt.  
Bei der spezifischen Transduktion kann die Phagen-DNA wenn es sich um temperente 
Phagen handelt auch als Prophage in des Bakteriengenom integriert werden. Gelegentlich 
werden dabei auch beim Ausscheren benachbarte Gene des Donorgenoms mit 
ausgeschnitten und bei der Integration in das Rezipientengenom mit übertragen. 

Dadurch sind sie unabhängig vom Replikationsapperat ihres jeweiligen Wirts. Wenn eine 
Phage zahlreiche unterschiedliche Bakterien befallen kann, so ist es wahrscheinlich, dass 
nicht alle Wirtsapperate für die Replikation auf das Phagengenom passen. Um also eine 
breite Auswahl unterschiedlicher Bakterien befallen zu können, muss der Phage seine 
eigenen Proteine für die Replikation codieren. Außerdem können dadurch die speziellen 
Bedürfnisse der Phagen, wie zum Beispiel sehr schnelle Replikation in sehr kurzer Zeit, 
besser erfüllt werden wie mit dem Replikationsapperat des Wirtes, der langsamer wäre. 
Ein weiterer Punkt könnte sein, dass die für die Replikation nötigen Komponenten, wenn 
sie von der Phagen-DNA codiert werden, spezifisch nur die Phagen-DNA replizieren und 
nicht das Wirtsgenom kopieren, was die Phagenproduktion erheblich verlangsamen würde.  

Eine Superinfektion würde bedeuten, dass mehrere temperente Phagen gleichzeitig eine 
Zelle infizieren. Der biologische Grund warum das unterbleiben soll ist, dass bei 
gleichzeitiger Replikation unterschiedlicher Viren nicht kontrolliert werden könnte, ob die 
jeweils passenden Komponenten assembliert werden und die Produktion der Viren sich 
jeweils gegenseitig hemmen würde. Dadurch könnte die falsche DNA in die falsche Hülle 
verpackt werden. Außerdem würde ein anderer Virus der die Zelle infiziert in einer 
anderen Replikationsphase sein und damit wahrscheinlich die Replikation des bereits 
vorhandenen Phagen erheblich stören.  
Der molekulare Mechanismus, der die Superinfektion verhindert, ist der CI-Repressor. 
Dieser Repressor verhindert die Transkription der Gene anderer, neu eindringender 
Phagen. Deshalb sind Bakterien mit einer lysogenen λ-Prophage immun gegenüber der 
Infektion mit anderen λ-Phagen. Kann der Repressor nicht an die Operatorsequenz eines 
neu eindringenden Phagen binden, so sind diese zwei Phagen heteroimmun, wenn sie die 
gleiche Operatorsequenz haben, können sie gegenseitig ihre Transkription hemmen und 
sind deshalb homoimmun.  

Für Bakterien ist es von Vorteil, wenn ihr Genom nicht mehr Gene enthält, als für ihr 
Überleben nötig ist, da diese sonst übermäßig den Stoffwechsel der Zellen belasten. Unter 
manchen Umständen jedoch, zum Beispiel in bestimmten Umgebungen wie bei der 
Infektion eines Menschen, sind Pathogenitätsfaktoren zum Überleben der Bakterien nötig 
und stellen nicht mehr einen Nachteil sondern einen Selektionsvorteil dar. Damit ist es 
sinnvoll, dass Pathogenitätsfaktoren oder Toxine außerhalb des stets vorhandenen 
Bakteriengenoms codiert werden. Dies ist möglich, indem diese Gene in Phagen verpackt 
sind, deren DNA durch Infektion in die Bakterien gelangen und dadurch zu deren 
Pathogenität beitragen kann.  

Im λ-Phagen wird die Antitermination für zwei Zwecke benutzt: zum einen wird das 
Protein N genutzt, um die Rekombinations- und Replikationsfunktionen zu regulieren, 
zum anderen wird das Protein Q genutzt um die Synthese der späten Proteine wie den 
Kopf- und Schwanzproteinen zu regulieren. Antitermination bedeutet, dass die 
Transkription trotz einem Terminator fortgesetzt wird.  Das N-Protein ermöglicht die Antitermination der Gene von nutR, welches die Gene O, Q 
und P, die die Replikation bzw. die Transkription  der späten Gene anschalten. Zudem 
wird nutL transkribiert, was die Gene gam und red einschließt. Diese haben 
Rekombinationsfunktion.  
Das Gen Q wird auch von dem N-Protein reguliert. Es ist auch ein Antiterminationsfaktor, 
der die Transkription von späten Genen ermöglicht. 

Das Cro-Protein ist eines der ersten Proteine, das nach der Induktion des Prophagen 
synthetisiert wird, und es hemmt die vermehrte Synthese des CI-Repressorproteins indem 
es an die Operatorsequenz bindet. CI ist verantwortlich dafür, dass der Prophage in 
lysogenen Zustand bleibt. Cro verhindert außerdem, dass CI an die Operatorsequenz 
binden kann und veranlasst seine eigene Synthese. Außerdem führt es zur Synthese von 
Int und Xis, was zur Excision des Prophagen aus dem Bakteriengenom führt.  

Lysogene Phagen haben als Klonierungsvektoren zahlreiche Vorteile. Die Phagen können 
viele Kopien herstellen und die Synthese von großen Mengen DNA und Protein 
ermöglichen. Außerdem ist es nicht so schlimm, wenn der Phage DNA trägt, die für ein 
toxisches Protein codiert, weil dieses nicht exprimiert wird bis der Phage die Zelle 
infiziert, und wenn das Bakterium infiziert ist, ist ihr Tod ohnehin vorprogrammiert. Des 
Weiteren ist es leicht, Genlibraries in den stabilen Köpfen des λ-Phagen so lagern. DNA 
in Phagenköpfen ist wesentlich stabiler als nackte DNA. 

Um herauszufinden, ob das Toxin von dem Prophagen codiert wird, muss man versuchen, 
den Prophagen zu induzieren, das heißt ihn in den lytischen Zyklus zu versetzen. Dies ist 
durch stressen der Zellen möglich (z.B. mit UV-Licht). Durch Einbau eines 
Selektionsmarkers wie zum Beispiel einer Resistenz in den Prophagen können die Zellen 
selektioniert werden, die nicht mehr resistent sind nach der UV-Bestrahlung. Um auf die 
Toxinproduktion der Zellen die den Prophagen verloren haben zu testen, könnte der 
gefilterte Überstand dieser Zellen auf eine humane Zellkultur gegeben werden. Wenn sie 
das Toxin noch exprimieren, gehen die humanen Zellen zu Grunde. Wenn der induzierte 
Prophage dann auf der Bakterienkultur Plaques erzeugt, dann kann der zellfreie Überstand 
mit den darin enthaltenen Phagen auf einen anderen S. aureus-Stamm (der das Toxin nicht 
herstellen kann) gegeben werden um zu sehen, ob dort auch Plaques entstehen. Von 
diesen Plaques können dann Lysogene isoliert werden, und es muss untersucht werden, ob 
die Lysogenen dieses Stamms, die dann auch den Prophagen tragen, das Toxin 
produzieren.