Bakteriengenetik Teil 1

• unidirectional
  • Origin Region: oriV
  • Replikation ist beendet, wenn die Replikationsgabel wieder am Ursprung ankommt
• bidirectional
  • Replikation ist beendet, wenn die Replikationsgabeln sich etwa gegenüber vom Ursprung treffen
• Rolling circle Replikation
  • Doppelstrangbruch durch das plasmid-codierte Rep Protein, welches am 5'-Phosphatendean den Bruch gebunden bleibt
  • Das freie 3'OH Ende dient als Primer für die DNA Polymerase III, de um den Kreis repliziert und einen alten Strang zum Einstrang-DNA macht
  • Das Rep-Protein macht einen erneuten Bruch, und entlässt den einzelsträngigen Kreis
  • DNA-Ligase verknüpft dann die Enden um doppel- und einzelsträngige zirkuläre DNA zu erhalten
  • Die Wirts RNA Polymerase setzt dann einen Primer an den Einzelstrang DNA Origin (SSO) und Pol III repliziert den einzelstrang um einen weiteren Doppelstrang zu erhalten
  • DNA Pol I entfernt den Primer und ersetzt ihn mit DNA und LIgase verknüpft die Enden

1. Regulation über Protein und komplementäre RNA
   • bei Replikation wird viel Protein und RNA II (komplementär zu einem RNA-Strang) gebildet
   • RNA II bindet an DNA (codierender Strang)
   • RNase H verkürzt RNA II, die dann als Primer für die Replikation dient
   • bei zu viel Replikation wird auch RNA I gebildet, die komplementär zur RNA II ist und an diese bindet, sodass sie nicht mehr als Primer dienen kann --> keine Replikation
2. Regulation über Proteine und Antisense RNA
   • Promotor für RepA-Protein wird aktiviert, sodass RepA transkribiert und translatiert wird
   • RepA bindet dann an oriV und aktiviert die Replikation
   • CopB-Promotor wird aktiviert -> CopB blockiert RepA-Promotor
3. Regulation über Coupling
   • Bindungsstellen für RepA = Iterons
   • wenig RepA -> bindet an Iterons und initiiert Replikation
   • hohe Kopienzahl (viele Plasmide) -> RepA bindet an Bindungsstellen von zwei Plasmiden und koppelt diese --> keine Replikation mehr möglich

Modell A

• Plasmid bindet an einzigartige Site der Bakterien-Membran
• 2 Kopien des Plasmids werden auseinandergezogen, während sich die Zelle teilt

Modell B

• 2 Kopien des Plasmids binden aneinander bevor sie an die Membransite binden
• mit jeder Seite assoziiert dann ein Plasmid wenn sich die Membran teil

Wenn keine Par-site vorhanden ist, haben die Plasmide eine glecihe Wahrscheinlichkeit für jede der Tochterzellen wenn sich die Zelle teilt. Teilweise gibt es Zellen, denen kein Plasmid vererbt wurde

Haben Plasmide die gleiche INkompatibilitätsgruppe (Inc), dann haben sie den gleichen Mechanismus zur Regulation ihrer Replikation und sind verwandt.

Hat eine Wirtszelle zwei Plasmide mit gleicher Inc, kann sie sich nicht entscheiden, welches Plasmid repilizert werden soll. SOmit verschwindet eins der Plasmide (bei Tranfer eines neuen Plasmid in eine Zelle, die bereits ein Plasmid mit gleicher Inc enthält, verschwindet das transferierte Plasmid). Plaside mit verscheidenen Inc-Gruppen können in einer Zelle koexistieren

Andere Inc-Gruppen kännen über eine leichter Veränderung, z.B. in der RNA I, erschaffen werden

verschiedene Inc-Gruppen entstehen über leichte Veränderungen im Mechanismus der DNA-Replikation (Veränderung der Kontrollelelemente der Replikation) z.B. durch Veränderungen in der RNA I, im ori-spezifischen Rep-Protein (Initiationsprotein, im Plasmid kodiert)

a) Regulation des Typ I Toxin-Antitoxin (TA) Systems

• Toxin- und RNA-Antitoxin-Gene werden separat transkribiert
• RNA Antitoxin bindet an die Toxincodierende mRNA
• sich bildender Duplex inhibiert die Translation der Toxinkodierenden mRNA

b) Regulation des Typ II TA Systems

• Antitoxin- und Toxin-kodierende mRNA werden vom gleichen Pomotor synthetisiert und translatiert um Proteine zu produzieren
• Das Antitoxin formt einen Komplex mit dem Toxin um die Toxizität zu hemmen und das TA Molekül zu autoregulieren
• Antitoxin allein kann auch das TA-System autoregulieren, allerdings schwächer als der TA Komplex
• Antitoxine werden von ATP-abhängigen Proteasen unter Stress geschnitten
• Diese Toxin-Aktivität führ zu Zellwachstum der Bakerien und eventuell zum Zelltot

Regulation des Typ III TA Systems

• RNA Antitoxin bindet an das Toxin-Protein und inhibiert die Toxizität

Übertragung von DNA vom Donor zum Akzeptor via Konjugation, durch Ausbildung Sexpilus! Plasmide, die zum Transfer in andere Bakterien befähigt sind, also alle Proteine die für Transfer benötigt werden selbst codieren sind self- transmissible. (Im Gegensatz zu zu mobilizable Plasmids, die nicht alle Gene zum Transfer selbst codieren somit also die Hilfe von self- transmissibles benötigen)

Die tra- Gene sind notwendig für eine selbstinduzierte Transmission. Tra gene sind trans- acting, können auch auf ein anderes Plasmid in der Zelle wirken. (OriT muss auch am Start sein, den würde ich aber nicht als Gengruppe sehen, tra gene liegen nah bei OriT = cis- acting site). Tra- Gene bestehen aus den beiden Gengruppen:

•  Mpf Gene = maiting pair formation – Große Membranassoziierter komplex, benötigt für Zell- zellkontakt, zusammenhalten von Donor und Rezeptor; beinhaltet auch den Pilus. Coupling Proteine senden dann die Information, dass Kontakt stattgefunden hat an die Dtr- Gene, genauer: Aktivierung der Relaxase danach finden DNA- Transfer statt
• Dtr Gene = DNA Transfer + Replikation Genprodukte der dtr Gene sind involviert in Prozessierung der Plasmid DNA für Vorbereitung für den Transfer. - Relaxase – Katalysiert ssBruch in der OriT- Sequenz (Transesterification) - Helikase – Katalysiert das Aufwinden der DNA in der OriT- Gegend - Primase – Machen den RNA- Primer, der für chromosomale Replikation benötigt wird 

Hfr-Stamm: F-Plasmid (mit oriT) ist in Chromosom eingebaut; ab oriT werden Teile des Chromosoms konjugiert (nur bestimmte Länge kann übertragen werden); Rekombination mit Chromosoms des Rezipienten

Selbst übertragende Plasmide = F-Plasmide (enthalten oriT, tra-Gene: MPF-Gene (maiting-pairformation -> „Verschmelzen“ der Zellen) und dtr-Gene (Relaxase -> bindet an MPF-Proteine und oriT, sorgt für Einzelstrangbruch in DNA und zieht DNA in Rezipientenzelle, Helicase, Primase))

Auxotroph = keine AS-Synthese

Prototroph = AS-Synthese

Hfr-Stramm überträgt per Konjugation einen Teil seines Chromosoms (ab oriT) auf die

Rezipientenzelle, werden die Gene für die His- und Trp-Synthese übertragen, wird der Rezipient diese in sein Chromosom einbauen, weil er damit einen Vorteil erlangt -> Rezipienten werden im optimalen Fall Arg-, His- und Trp-prototroph.

Auf dem Minimalmedium können nur Zellen überleben, die selbst Trp herstellen können.

Trp-Prototrophie ist demnach ein selektionierter Marker, da die Rezipientenzellen nur dann wachsen können, wenn ein Austausch zum prototrophen Trp-Gen stattgefunden hat. Ohne erfolgreiche Konjugation und Rekombination kein Wachstum.

Nicht-selektionierte Marker sind Arg- und His-Prototrophie, da diese AS im Medium vorhanden sind und für die Zelle keinen Wachstumsvorteil bilden. 

Selektionierter Marker ist das Gen für die Trp-Prototrophie. Da Arg und His im Medium 
vorliegen, benötigen Zellen um darauf zu wachsen keine Mechanismen um es selbst 
herzustellen, und sowohl diejenigen die auxotroph für Arg und His sind als auch die 
prototrophen können darauf wachsen. Somit sind die Arg- und His-Prototrophie nicht selektionierte Marker. Da Trp aber im Medium fehlt, können nur solche Zellen darauf 
wachsen, die diese Aminosäure selbst herstellen können. Somit wird auf Trp-Prototrophie 
selektioniert.  

Broad host-range Plasmid = breites Wirtsspektrum des Plasmids

-> Mechanismen für DNA-Replikation müssen unspezifisch sein, da Replikations-Mechanismen je nach Wirt variieren können oder die Replikation des Plasmids muss komplett unabhängig von DNA-Replikation des Wirtes sein

Ob bestimmte Proteine für die Replikation eines Plasmids nötig ist, könnte durch temperatursensitive Mutanten herausgefunden werden, der diese Wirtsproteine nur unterhalb einer bestimmten Temperatur funktionsfähig exprimiert. Das Plasmid wird in diese Mutanten eingeführt und die Temperatur erhöht. Dann wird beobachtet, ob das Plasmid bei der hohen Temperatur die das Protein nicht mehr aushält noch repliziert wird. Die Plasmidreplikation könnte zum Beispiel durch radioaktiv gelabelte Nucleotide nachgewiesen werden, die nach der Temperaturerhöhung dazugegeben wurden. Wenn die dann entstehende radioakive mit Plasmid-DNA hybridisiert, wurde das Plasmid auch ohne das hitzesensitive Protein repliziert.  

• Vorteile:
  • Durch ständiges Vorhandensein der Gene für die Regulation kann ein Plasmid einfacher aufgenommen werden, weil seine Replikation nicht davon abhängig ist, dass das neu aufgenommene Plasmid erst abgelesen wird und die Gene die es trägt exprimiert werden müssen. So können auch Plasmide aufgenommen werden, die die gleichen Regulationselemente tragen, selbst aber nicht für die entsprechenden Proteine codieren.  
  • Plasmid ist kürzer als Wirts-Chromosom und hat somit nur Platz für eine begrenzte Anzahl 
    an Genen -> Ähnlichkeit der Plasmid-Replikation zur Replikation der Wirts-DNA -> Plasmid kann 
    teilweise über gleiche Proteine reguliert werden und braucht diese nicht selbst codieren 
• Nachteile:
  • Die Gene stellen eine ständige Zusatzbelastung für die Bakterien dar, wenn kein Plasmid vorhanden ist. Sie sind also selbst dann vorhanden, wenn sie gar nicht benötigt werden und nur unnötigen Ballast darsellen.
  •  Replikation und Regulation der Replikation eines Plasmides ist von der Wirtszelle 
    abhängig, ein Plasmid kann sich nicht ohne eine Wirtszelle replizieren 

Kompetenz ist die Fähigkeit von Zellen, v.a. Bakterien, frei im umgebenden Medium vorhandene DNA 
aufzunehmen. Sie bildet die Voraussetzung für die Transformationsfähigkeit von Zellen. 
Nur bestimmte Bakterienarten haben com-Gene, deren Produkte freie DNA erkennen, aufnehmen 
und ins Genom rekombinieren. 
Sie kann auch künstlich hergestellt werden, z.B. durch Elektroporation oder Hitzeschock. 

• Vorteile:
  • durch Aufnahme freier DNA können mutierte DNA-Abschnitte repariert oder Fremdgene aufgenommen werden, die einen evolutionären Vorteil bieten können, z.B. Herstellung einer bestimmten AS 
  •  Des Weiteren könnten mit 
    der aufgenommenen DNA Schäden am Genom der Zelle ausgebessert werden, sie könnte 
    sogar als Nahrung dienen, oder für eine Kombination der genannten Gründe 
    aufgenommen werden
• Nachteile:
  • für die Aufnahme der DNA sind Poren in der Zellmembran nötig, durch die auch für die Zelle gefährliche Stoffe eindringen können, aufgenommene freie DNA ist nicht oft die „richtige“ für Reparatur des Genoms
  • die Kompetenz anscheinend 
    zahlreiche Proteine vorhanden sein müssen, die den Stoffwechsel einer Zelle belasten und 
    einen zusätzlichen Aufwand darstellen. 

 
Wenn die tra-Gene und der oriT, zu dem sie gehören, nahe beieinander liegen, dann ist die 
Wahrscheinlichkeit, dass eine Rekombination auftritt, die die Gene und den oriT 
voneinander trennt, sehr unwahrscheinlich. Wenn die tra-Gene von dem oriT zu dem sie 
gehören getrennt würden, so würden sie ihre Funktion verlieren und das Plasmid könnte 
nicht mehr übertragen werden.  

 Es wird ein Rezipient verwendet, der eine temperatursensitive Mutation in seinem Primase-Gen aufweist. Wenn das Plasmid nicht für seine eigene Primase codiert, so bleibt es nach dem Transfer einzelsträngig (bei entsprechender 
Inaktivierung der hitzesensitiven Primase der Rezipientenzelle). Einzelsträngige DNA ist gegenüber einigen DNAsen anfälliger als doppelsträngige und verhält sich unterschiedlich in Gelelektrophorese. 

Wenn die Resistenz mit einem Plasmid übertragen wurde, so muss die resistente Zelle auch das entsprechende Plasmid enthalten. Bei einem Transposon würde kein entsprechendes Plasmid vorliegen. Außerdem sollte ein ransposon im Southern Blot dann andere benachbarte Sequenzen aufweisen als in der Ursprungszelle.  
 

Generelles zu Suizid- Plasmid (k.a. who the fuck is pKO3?) Jede DNA, z.B. Plasmid oder Phagen DNA, die nicht in einem speziellen Wirt replizieren kann ( also kein Replikon darstellt) kann als Suizid- Vektor verwendet werden. Bei Eindringen in den Wirt führt es unweigerlich zum ‚Tod‘ der DNA. Verwendung von Suizid- Vektoren: Suizid- Vektoren können zur Transposition verwendet werden, indem sie ein Transposon tragen für bspw. Resistenz. Suizid- Plasmide werden durch Konjugation übertragen. Sobald das Plasmid in der Wirtszelle ist, kann das Transposon springen. Nur wenn das Transposon erfolgreich ins Wirtsgenom integrieren konnte kann die Zielzelle resistent sein, dadurch ist mit Hilfe des Suizid- Plasmides eine direkte Selektion auf Genomintegration ja/nein möglich (kann auch in ein in der Zelle vorhandenes Plasmid integriert habeb). Genomintegration bedeutet (insertionelle) Mutagenese. Bei normalen Plasmiden kann Plasmid in Zelle sein = resistent aber ungleich Integration! Im Prinzip können alle Plasmide als Suizid- Vektoren verwendet werde, bei denen in einem für die Plasmid- Replikation benötigtes Gen eine conditional- lethale, temperatursensitive, oder nonsense Mutation vorliegt. Vorgehensweise: Fortpflanzung/Vermehrung des Plasmids in einem Stamm, in dem es replizieren kann, dann Introduktion in ein System, in dem es nicht replizieren kann.