Antikörper
AK als Werkzeug der Molekularbiologie
AK als Werkzeug der Molekularbiologie
Was sind AK und was ist ihre Aufgabe?
Antikörper sind die Vermittler der erworbenen Immunantwort. Sie werden von Plasmazellen gebildet, die sich aus B-Lymphozyten entwickeln. Danach bilden sich Gedächtniszellen, die bei einem Zweitkontakt mit dem Antigen eine stärkere Immunantwort aufbauen.
Die Hauptaufgabe der Antikörper ist es Pathogene spezifisch zu binden und diese so für das Immunsystem zur Entsorgung zu markieren.
Wie sind AK aufgebaut?
leiten sich aus dem Ig-Grundmodell ab (Form eines Y hat)
bestehen aus 2 verschiedenen Arten von Ketten, die sich in Molekülmasse unterscheiden.
2 leichten Ketten (L-Ketten)
- 1 variable Domäne (Aminoterminal) (VL)
- 1 konstante Domäne. (Carboxyterminal) (CL)
2 schweren Ketten (H-Ketten)
- unterscheiden sich stärker voneinander
- für die Antikörperspezifität, als auch für die Zugehörigkeit zu den Ig-Klassen verantwortlich.
- variable Domäne am aminoterminalen Ende besteht wie bei den leichten Ketten aus 110 Aminosäuren.
- konstante Region ist bei den schweren Ketten, je nach Klasse in 3 bzw. 4 Domänen unterteilt.
Was ist die Antigenbindungsstellen?
Die Antigenbindungsstelle setzt sich aus den Domänen VH und VL zusammen.
Innerhalb der variablen Domänen variieren die Aminosäuren jedoch nicht immer
gleich stark. Es gibt hypervariable Bereiche und diese sind für die Spezifität des
Antikörpers maßgebend. Der Antikörper kann nur mit dem Epitop des Antigens
reagieren, wenn die hypervariablen Bereiche der H und L-Ketten die geeignete
Aminosäuresequenz aufweisen.
Was sind monoklonal AK & wofür werden sie eingesetzt?
- B-Zelle wird mit Tumorzelle fusioniert
- Hybridom
- produziert einen spezifischen AK und kann in Kultur unbegrenzt wachsen
Können nur an ein Epitop des Antigens binden, aber können spezifisch gegen einen
Krankheitsprozess eingesetzt werden + ELISA, Western Blot, FACS
Was sind Polyklonale AK & wofür werden sie verwendet?
- Tieren (z.B: Ziegen, Ratten, …) werden Antigene gespritzt
- Tier bildet A
- ein natürliches Gemisch aus verschiedenen AK die an jeweils andere Epitope des Antigens binden
Können vielseitiger eingesetzt werden. Immunoassays, passive Immunisierung
Wie funktioniert der Nachweis mittels AK?
2-STUFIG
Immunoassays. Die Anweseneheit eines AK oder Antigens und dessen Konzentration kann bestimmt werden.
Der nachzuweisende Stoff wird an den Boden eines Reaktionsgefäßes gebunden.
Dann wird AK/Antigen hinzugegeben = Primär-AK
Markierter AK der an Primär-AK bindet hinzugegeben = Sekundär-AK
= indirekter Nachweis für das Antigen
Bei AK als nachzuweisendes Target wird statt Primär-AK ein Antigen mit 2 AK-Bindungsstellen zugegeben (für Target-AK und Sekundär-AK)
Wie können AK markiert werden?
- Radioaktiv (aufwendig und teuer; IRMA = immuno Radiometric Assay))
- Fluorochrome (nicht sehr verbreitet)
- ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) am häufgsten verwendet
Wie funktioniert ELISA?
= enzyme-linked-immuno-assay; zum Nachweis der Antigenkonzentration
- Gesuchtes Antigen wird an die Mikrotiterplatte gebunden (über einen AK)
- Inkubation, Absaugen, Waschen
- Freigebliebene Stellen blockiert (z.B: Caseinlösung für 2h, waschen)
- Primär-AK
- Inkubieren, waschen
- Sekundäre-AK (mit alkalischer Phosphatase markiert)
- Inkubiert, gewaschen
- P-Nitrophenolphosphat hinzugegeben
- Extinktion bei 405nm alle 5min gemessen
- pNPP wird in das gelbe p-Nitrophenol gespalten.
- Zeitkurve gibt Hinweis auf Konzentration des Antigens
Wozu dient AK-Titration?
Bindung von AK an Antigen hängt von mehrere Faktoren ab (pH-Wert, Temperaturm etc.)
Da die Antigen-Konzentration nicht verändert werden kann, muss die richtige AK-Konz. vor dem Versuch bestimmt werden.
Optimum: stärkste Reaktion für einen positiven Test mit möglichst geringen Hintergrund-Reaktionen
Primär-AK und Sekundär-AK müssen vor jedem Versuch neu titriert werden, aber es gibt Richtwerte an denen man beginnen kann.
- Mehrere Verdünnungen herstellen
- Auswahl einer fixen Inkubationszeit
- Jede Verdünnung mit derselben Probe getestet
- Auswertung makroskopisch (Agglutination) und quantitativ (Western Blot)
Welche Anwendungen gibt es für AK?
- Nachweis von Infektionskrankheiten
- Unterschiede der Konzentration in der Schwangerschaft
Für welche Methoden verwendet man AK?
- ELISA
- Western Blot
- FACS
Was sind rekombinante AK?
Herstellung durch Phagendisplay, ermöglicht gegen jedes Antigen einen AK herzustellen ohne Immunisierung und Versuchstiere
Anwendungen: Krebstherapie, Asthma, Alzheimer
2002 „Humira“ erster humane rekombinante AK zugelassen
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Was sind AK und was ist ihre Aufgabe?
Antikörper sind die Vermittler der erworbenen Immunantwort. Sie werden von Plasmazellen gebildet, die sich aus B-Lymphozyten entwickeln. Danach bilden sich Gedächtniszellen, die bei einem Zweitkontakt mit dem Antigen eine stärkere Immunantwort aufbauen.
Die Hauptaufgabe der Antikörper ist es Pathogene spezifisch zu binden und diese so für das Immunsystem zur Entsorgung zu markieren.
Wie sind AK aufgebaut?
leiten sich aus dem Ig-Grundmodell ab (Form eines Y hat)
bestehen aus 2 verschiedenen Arten von Ketten, die sich in Molekülmasse unterscheiden.
2 leichten Ketten (L-Ketten)
- 1 variable Domäne (Aminoterminal) (VL)
- 1 konstante Domäne. (Carboxyterminal) (CL)
2 schweren Ketten (H-Ketten)
- unterscheiden sich stärker voneinander
- für die Antikörperspezifität, als auch für die Zugehörigkeit zu den Ig-Klassen verantwortlich.
- variable Domäne am aminoterminalen Ende besteht wie bei den leichten Ketten aus 110 Aminosäuren.
- konstante Region ist bei den schweren Ketten, je nach Klasse in 3 bzw. 4 Domänen unterteilt.
Was ist die Antigenbindungsstellen?
Die Antigenbindungsstelle setzt sich aus den Domänen VH und VL zusammen.
Innerhalb der variablen Domänen variieren die Aminosäuren jedoch nicht immer
gleich stark. Es gibt hypervariable Bereiche und diese sind für die Spezifität des
Antikörpers maßgebend. Der Antikörper kann nur mit dem Epitop des Antigens
reagieren, wenn die hypervariablen Bereiche der H und L-Ketten die geeignete
Aminosäuresequenz aufweisen.
Was sind monoklonal AK & wofür werden sie eingesetzt?
- B-Zelle wird mit Tumorzelle fusioniert
- Hybridom
- produziert einen spezifischen AK und kann in Kultur unbegrenzt wachsen
Können nur an ein Epitop des Antigens binden, aber können spezifisch gegen einen
Krankheitsprozess eingesetzt werden + ELISA, Western Blot, FACS
Was sind Polyklonale AK & wofür werden sie verwendet?
- Tieren (z.B: Ziegen, Ratten, …) werden Antigene gespritzt
- Tier bildet A
- ein natürliches Gemisch aus verschiedenen AK die an jeweils andere Epitope des Antigens binden
Können vielseitiger eingesetzt werden. Immunoassays, passive Immunisierung
Wie funktioniert der Nachweis mittels AK?
2-STUFIG
Immunoassays. Die Anweseneheit eines AK oder Antigens und dessen Konzentration kann bestimmt werden.
Der nachzuweisende Stoff wird an den Boden eines Reaktionsgefäßes gebunden.
Dann wird AK/Antigen hinzugegeben = Primär-AK
Markierter AK der an Primär-AK bindet hinzugegeben = Sekundär-AK
= indirekter Nachweis für das Antigen
Bei AK als nachzuweisendes Target wird statt Primär-AK ein Antigen mit 2 AK-Bindungsstellen zugegeben (für Target-AK und Sekundär-AK)
Wie können AK markiert werden?
- Radioaktiv (aufwendig und teuer; IRMA = immuno Radiometric Assay))
- Fluorochrome (nicht sehr verbreitet)
- ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) am häufgsten verwendet
Wie funktioniert ELISA?
= enzyme-linked-immuno-assay; zum Nachweis der Antigenkonzentration
- Gesuchtes Antigen wird an die Mikrotiterplatte gebunden (über einen AK)
- Inkubation, Absaugen, Waschen
- Freigebliebene Stellen blockiert (z.B: Caseinlösung für 2h, waschen)
- Primär-AK
- Inkubieren, waschen
- Sekundäre-AK (mit alkalischer Phosphatase markiert)
- Inkubiert, gewaschen
- P-Nitrophenolphosphat hinzugegeben
- Extinktion bei 405nm alle 5min gemessen
- pNPP wird in das gelbe p-Nitrophenol gespalten.
- Zeitkurve gibt Hinweis auf Konzentration des Antigens
Wozu dient AK-Titration?
Bindung von AK an Antigen hängt von mehrere Faktoren ab (pH-Wert, Temperaturm etc.)
Da die Antigen-Konzentration nicht verändert werden kann, muss die richtige AK-Konz. vor dem Versuch bestimmt werden.
Optimum: stärkste Reaktion für einen positiven Test mit möglichst geringen Hintergrund-Reaktionen
Primär-AK und Sekundär-AK müssen vor jedem Versuch neu titriert werden, aber es gibt Richtwerte an denen man beginnen kann.
- Mehrere Verdünnungen herstellen
- Auswahl einer fixen Inkubationszeit
- Jede Verdünnung mit derselben Probe getestet
- Auswertung makroskopisch (Agglutination) und quantitativ (Western Blot)
Welche Anwendungen gibt es für AK?
- Nachweis von Infektionskrankheiten
- Unterschiede der Konzentration in der Schwangerschaft
Für welche Methoden verwendet man AK?
- ELISA
- Western Blot
- FACS
Was sind rekombinante AK?
Herstellung durch Phagendisplay, ermöglicht gegen jedes Antigen einen AK herzustellen ohne Immunisierung und Versuchstiere
Anwendungen: Krebstherapie, Asthma, Alzheimer
2002 „Humira“ erster humane rekombinante AK zugelassen
