Affekacke Proteinbiosynthese

Ort: Zellkernn
Ziel: Erzeugen von RNA (Ribonukleinsäure)
Zucker: Ribose
Uracil statt Thymin

Transkriptionsinitiation

1. Transkriptionsfaktoren (TFIID für RNA-Polymerase II + TFIIH-Helikase) binden an Kernpromotor (TATA-Box bei regulierten Genen, Inr-Element (Initiationselement) bei ständig exprimierten Genen (konstitutive Gene)). 
2. Anlagerung der RNA-Polymerase (II)

Transkriptionselongation

1. Entspiralisieren und Trennen der Basenpaare durch Helikase (Rückführung durch Helikase hinter RNA-P). Entstehung des Transkriptionsauges
2. Zunhemende Verdrillung wird durch Topoisomerasen rückgängig gemacht
3. Synthetisieren von 5' nach 3', somit lesen der Matrize von 3' nach 5'
4. Einsetzen des ersten Ribonukleosidphosphats (i.d.R. ATP)
5. Weitere Synthese von ATP, UTP, CTP und GTP unter Pyrophosphatabspaltung, d.h. Nukleotidmonophosphat in RNA!

Transkriptionstermination

1. Transkriptionsende und Ablösen des Enzyms an Poly(A)-Signal (Konsensussequenz AATAAA)

Etwa 2.000 der rund 30.000 menschlichen Gene sind sogenannte konstitutive Gene (Haulshaltsgene), die von jeder Zelle gleichermaßen benötigt werden und kontinuierlich bei niedriger Expressionsrate abgelesen werden (z.B. Enzyme der Glykolyse)
Induktive Gene unterliegen Regulation:

• Entwicklungsabhängig (z.B. Embryonalstadium)
• Gewebeabhängig (z.B. Leber anders als Gehirn)
• Umweltbedingt / Hormongesteuert
• (Pflanzen haben zusätzl. lichtabhängige Expression)

Regulation erfolgt in verschiedenen Ebene:

• Transkription
• posttranskriptionel
• Translation

Einfluss durch:

• DNA Steuerelemente (Abschnitte auf DNA) (wenn auf selbem Chromosom, dann cis-aktives Element)
• DNA-bindende Proteine (Transkriptionsfaktoren) (trans-argierende Faktoren)

• Regulative DNA-Sequenz, die Expression amplifiziert (Verstärkerlemente) oder senken (Repressoren)
• Distales Promotoelement (ggf. mehrere 1000 BP 3' oder 5' vom Gen)
• Verstärkung bis auf 1000-fache
• Orientierung irrelevant für Funktion
• Zum Teil Zell- und Gewebespezifisch (d.h. gewebespez. Expression)
• Steuerung durch interne Stimulation oder Hormone (Induzierbarkeit)

• Acetylierung
  Histon-Acetyltransferasen (HATs) acetylieren Histone, die dann ihre positive Ladung verlieren und nicht mehr an DNA binden ⇒ Transkriptionsfaktoren/Enzyme können binden
• Desascetylierung
  Histon-Desacetylase (HDAC) kehrt Acetylierung um

• Vokommen: CpG-Inseln auf DNA (Cytosin-Nukleotid, auf das ein Guanin-Nukleotid folgt, normal verbunden durch Phosphat)
• Verhindert Transkription
• Übertragung von Methyl-Gruppen durch DNA-Methyltransferasen (Dnmt) unter Hilfe von S-Adensoly-Methionin (SAM)
• Meisten CpG-Inseln methyliert, außer die, die sich im Promotorbereich transkriptionell aktiver Gene befinden (d.h. Methylierung=Veringerung der Gen-Expression)
• Tumorzellen nutzen Methylierung um zu Überleben

• Erhaltung der Methylierung nach Replikation durch Dnmt 1
• De-novo-Methylierung erlaubt Eingriff in Expression: Soll Gen abgeschlatet werden, erfolgt daher Methylierung in dessen Promotor durch Dnmt 3a und Dnmt 3b (Wichtig: beide Stränge müssen methyliert werden, um Informationserhalt zu gewährleisten)
• Umkehrung durch Demethylierung

Startpunkt der Transkription ⇒ Bindestelle für RNA-Polymerase

• Initiator-Element (Inr-Element)
  i.d.R. bei konstitutiven Genen (Haulshaltsgene)
• TATA-Box
  Bei induktiven Genen (regulierte Gene)
  Befindet sich etwa. 25 Nukleotide stromaufwärts des Gens (Konsensussequent: 5' TA TA AT 3')
  Bindungsstelle fpr RNA-Polymerase II unter mithilfe v. Transkriptionsfaktoren (besonders TF II D)

Virale Promotoren enthalten, im Gegensatz zu Prokaryonten, auch eukaryontische Promotoren

Proximale Elemente sind in beiden Orientierungen Aktiv, wehslab egal ist auf welchem Strang sie sich befinden (im Gegensatz zu Kernpromotor)

• GC-Box
  Ganin- und cytosin-reiche Region (ca. 40 BP vor Gen)
• CAAT-Box
  Etwa 110 BP vor Gen
• E2 F-Elemente
  Steuern Aktivität von Zellzyklusabhängigen Genen (siehe RB-Protein)

• Basale Transkriptionsfaktoren
  • Konstitutiv exprimiert
  • Binden an Kernpromotoren ⇒ Bildung des Initialkomplexes ⇒ basale Transkriptionsrate
  • Jede RNA-Polymerase hat eigene Faktoren (TF I, TF II, TF III)
  • Nochfolgende Buchstaben geben genauere Verwendung an (TF II D ist TATA-Box-Binding-Protein TBP)
• Stromaufwärtsbindende Transkriptionsfaktoren
  • Binden an stromaufwärts befindliche regulatorische Elemente
  • Biosynthese erfolgt reuguliert nach Entwicklungsstand und Bedarf der Zelle
• Induzierbare Transkriptionsfaktoren
  • Entscheiden sich zu stromaufwärtsbindenden durch Notwendigkeit der Aktivierung
  • Befinden sich entweder im Cytoplasma oder Zellkern (ggf auch schon an DNA)
  • P53 als Beispiel

Edditieren der hnRNA zu mRNA im Zellkern!

1. Capping
   • GTP bindet über 5' an 5'-Ende/Anfang der RNA
   • RNA 5' gibt dabei ein Phosphat ab, GTP wird zu GMP
   • Guanin wird an N7 methylisiert durch S-Adenosin-Methionin (SAM)
   • Soll Spleißvorgang dienen, Transport ins Zytoplasma, Stabilität und Initiation der Translation
2. Polyadenylierung
   • Poly-A Signal dient zunäcshst als Stopp für RNA-Polymerase und als Start für Poly-A-Polymerase
   • Sie hängt etwa 250 AMPs an (ATP⇒AMP hydrolysiert)
   • Dient Stabilisierung und nukleozytoplasmatischem Transport, sowie Regulation der Halbwertszeit
   • mitochrondriale mRNS und einige Histon-mRNA ohne Poly-A-Schwanz
3. Splicing
   • Entfernen von Introns und Spleißen/Verbinden der Exons
   • Findet im Spleißosom statt
   • freie 2'-OH-Gruppe eines Adenosins, in AU-reicher-Region des Introns, bindet an 5'-Intron-Exon-Übergang (5'-2'-Phosphodiesterbindung)
   • Spleißsignal bilden GU-AG-Bereiche (meistens)
   • Exons werden nun verbunden
   • Introns werden zu Mononukleotiden abgebaut
4. mRNA-Editing
   • Verändern einzelner Nukleotide, so dass z.b. andere Aminosäuren oder Stoppcodons eingefügt werden
   • Bsp: Lipidstoffwechsel Protein aus Leber Apo B100 (513kD)
     Durch Basenaustausch an Codon 2152 (Cytosin statt Uracil durch Cytidin-Desaminase) ensteht Stoppcodon. Da Enzym nur noch 48% des Molekulargewichts ⇒ Apo B48 (Entsteht nur in Darmzellen, da Cytidin-Desaminase nur hier exprimiert wird)
5. Alternatives Spleißen
   • Statt Introns werden hier auch Exons rausgeschnitten
   • Bsp: Immuglobulin wird so in einer membranbeständtigen und einer gelösten Form exprimiert

Aminoacyl-RNA

1. Aktivierung der Aminosäure
   findet im Zytosol statt. Aminosäure bindet an ATP unter Abspaltung von Pyrophosphat (Hydrolyse) ⇒ Aminoacyl-AMP
2. Bindung an tRNA
   Aminoacyl-AMP wird mittels Aminoacyl-tRNA-Synthetase auf tRNA übertragen und Abspaltung des AMP
   BINDUNG ERFOLGT IMMER 5'-CCA-3' ENDE DER tRNA

• Eukaryonten (4 rRNA-Typen und ca. 80 Proteine)
  • Große Untereinheit (60S)
    (28S-rRNA, 5,8S-rRNA und 5S-rRNA) + 49 Proteine
  • Kleine Untereinheit (40S)
    18S-rRNA + 33 Proteine
  • Wird in Nucleoli zusammengebaut
  • Freie Ribosomen produzieren im Zytoplasma, i.d.R. für Zytoplasma
  • Membrangebundene Ribosomen produzieren in Lumen des rauhen ER
• Prokaryonten
  • Großte Untereinheit (50S)
    (23S-rRNA und 5S-rRNA) + 32 Proteine
  • Kleine Untereinheit (30S)
    16S-rRNA + 21 Proteine
  • Sehr Ähnlich der mitochondrialen Ribosomen (Endosymbiontentheroie)

Ort: Zytoplasma
Ziel: Erzeugung von Proteinen
Bindung: Peptid

Translationsinitiation

1. Kleine Untereinheit erkennt Kappe an 5'-Ende
2. Protein gleitet an kleiner Untereinheit entlang bis Startcodo AUG erkannt wird (Methionin)
3. Komplex aus eIF-2 (eukaryontischer Initiationsfaktor 2) (+eIF 1, 2 und 3) und GTP bindet an tRNA
4. Dieser Initiationskomplex bindet an kl. Untereinheit (Peptidyl-Bindungsstelle P)
5. GTP wird am eIF-2 hydrolysiert und GDP+eIF-2 und P abgeben
6. Nach Abspaltung kan gr. Untereinheit anlagern ⇒ Ribosm funktionsfähig

Translationselongation

1. aatRNA mit richtigem Anticodon bindet mit eukaryontischem Elongationfaktor-1 alpha (eEF-1alpha)+GTP, unter Abspaltung von eEF-1alpha+GDP und P, an die Aminoacyl-Bindestelle (A)
2. Peptidyltransferase (Ribozym aus rRNA in 60S) bindet die Aminosäuren aus der P-Stelle mit der in der A-Stelle (Peptidylkette hängt an A) 
3. tRNA velässt P-Stelle und tRNA aus A rückt nach P

Translationstermination

1. Erscheint Stoppcodon (UAG, UAA, oder UGA) bindet keine tRNA sondern eRF (eukaryontic release factor). Peptidkette wird durch Wassermolekül von Peptidyl-tRNA abgespaltet (hydrolytische Spaltung) und freigesetzt
2. Ribosom zerfällt in Untereinheiten

Binden mehrere Ribosomen an eine RNA ⇒ Polysomen

Translation der Globin-mRNA erfolgt nur dan, wenn auch genügen Häm-Moleküle (und damit Eisen) in der Zelle vorhanden sind. Ist dies nicht der Fall, so wird der eIF2 durch eine Häm-kontrollierte Proteinkinase phosphoriliert. Eine Translation findet dann nicht mehr statt.

• Zytosolischer Weg ⇒ Keine Signalsequenz für ER ⇒ Biosynthese vollst. in Cytosol https://www.youtube.com/watch?v=78Tm2i-u4-s
  • Proteine für Zytosol (z.B. Enzyme)
  • Proteine für Mitochondrien (Translokationssequenz) https://www.youtube.com/watch?v=LfDYGanMi6Q
  • Proteine für Zellkern (Nukleäre Translokationssequenz - NLS)
  • Proteine für Peroxisomen (Translokationssequenz)
• Sekretorischer Weg https://www.youtube.com/watch?v=PUy_Em5dXmc
  Synthese beginnt im Cytosol, bis Signalerkennungs-Partikel Sequenz erkennt und weitere Synthese unterbindet.
  1. Ribosom-Einheit wird mit Signalerkennungs-Partikel an passenden Rezeptor am ER vermittelt
  2. Weitergabe an "Translocon" (Protein translocation channel) und Öffnung durch Signalsequenz
  3. Translation wird ins Lumen des ER fortgesetzt
  4. Signal-Peptidase trennt Signalsequenz von Aminosäure
  5. (Membranproteine: Manche Proteine bleiben in der Membran des ER, bzw. werden in diese hinein synthetisiert (ein- oder mehrfach hydrophobe Abschnitte). Ggf. Abtransport durch Vesikel) 
  6. Über Vesikel werden die Proteine an den Golgi-Apperat gebracht und da Modifiziert
  7. Über weitere Translokationssignale erfolgt eine Verschickung an Bestimmungsort (ggf. zurück ins ER) https://www.youtube.com/watch?v=GnlmWUm1Xmk
  • Exportproteine (Kollagen, Insulin u.a. Plasmaproteine)
  • Membranproteine (s. 5.)
  • Proteine für ER und Golgi (ER Proteine werden über KDEL Amino-Sequenz zurückdirigiert
  • Lysosomale Proteine (Da auch Bildung des Lysosoms durch Golgi erfolgt)